타액 항체 멀티 플렉스 면역을 개발하는 것은 환경 병원체의 인체 노출을 측정하는
1National Exposure Research Laboratory,U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory,U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences,University of Cincinnati
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
병인 및 환경 병원체의 인체 노출의 영향에 따라서, 노출 및 감염을 사용하여 비용 효과적인, 높은 처리량 접근 방식을 평가하는 능력이 필수 불가결 한 것, 전세계 주요 관심사이고. 이 논문은 다수의 병원체를 동시에 인간 타액 항체의 존재를 측정 할 수있는 비드 기반 다중 면역 개발 및 해석을 설명한다. 그것은, 비 침습적 저렴하고 혈청보다 수집하기 쉽기 때문에 침이 응용 프로그램에서 특히 매력적이다. 환경 병원체로부터 항원 카르 미립자 (비드)에 커플 링 비드 기반 용액 상 분석을 이용하여 인간의 타액 샘플의 매우 작은 양의 항체를 측정하는데 사용 하였다. 구슬은 캄 필로 박터 jejuni와, 헬리코박터 파이로리, 톡소 포자충, noroviruses (G I.1과 G II.4)에서 항원과 A 형 간염 바이러스와 결합되었다. 항원이 충분히에 연결되었는지 확인하려면비드가 결합은 비 오티 닐화 항 – 종 차 검출 항체 및 스트렙 타비 딘 – 피코 에리 트린 R 기자 (SAPE)와 인큐베이션 한 후, 종 특이 동물 유래 기본 캡쳐 항체를 사용하여 확인 하였다. 그것은 임의의 항원에 결합되지 않은 것을 제외하고 비특이적 결합을 측정하기위한 대조군으로서, 하나의 비드 세트는 다른 동일하게 처리 하였다. 항원 – 결합 및 제어 비드는 유동 세포 계측법의 원리에 기초하여 높은 처리량 분석기상에서 측정 전진 수집 된 인간 타액 샘플과 함께 배양하고, 각 항원에 대한 항체의 존재는 중간 형광 세기 단위 (MFI)를 측정했다 . 다중화 면역 적은 샘플 이상의 데이터를 포함하는 장점들을 갖는다; 비용 절감과 노동; 과 능력은 관심이 많은 대상에 분석을 사용자 정의합니다. 결과 침 다중 면역 especia가 될 수있는 이전의 노출과 감염을 식별 할 수있는 것을 나타내는큰 인간 집단을 포함하는 감시 연구 에서야 베드로 유용합니다.
Introduction
설사 관련 질병의 88 %가 전 세계적으로 약 150 만 명이 사망 원인이 오염 된 물에 대한 인체 노출 안전하지 않은 음식, 그리고 가난한 위생 / 위생과 연관되어, 대부분의 어린이 1입니다. 이는 공중 보건 관리 및 정책 결정자에 대한 관심의 주요 원인이다. 수성 및 기타 환경과 관련된 병원체 노출과 질병을 조사하기 위해, 우리는 사람의 샘플 2-4에 대한 항체를 측정하는 다중 면역 분석을 개발 하였다. 이 방법은 이러한 병원체의 인체 노출을 결정하기 위해 더 나은 immunoprevalence 및 사고 감염을 정의하는 역학 연구에 적용 할 수 있습니다.
침은 인간의 바이오 마커 연구를위한 혈청의 대안으로 상당한 약속을 보유하고있다. 타액의 장점 중에서는 비 침입 및 샘플 수집, 저비용의 용이성, 그리고 샘플 아이 쉽게 5-7 <로부터 회수 할 수있다/ SUP>. 혈청 및 타액 샘플 H.에 대한 항체에 대해 광범위하게 연구되어왔다 파이로리 2,3,8, 말라리아 원충 (9), Entamoeba의 아메바 (10),와 포자충 포자충 3,11, 연쇄상 구균 폐렴 (12), 간염 바이러스 A와 C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. 포자충 2-4, 뎅기열 바이러스 16, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) (17), 대장균 O157 : H7 18.
멀티 플렉스 면역 동시에 하나의 샘플 볼륨 내에서 단일주기 또는 실행 내에서 여러 분석의 분석이 가능합니다. C.에서 멀티 플렉스 항원 jejuni와, T. 포자충, H. 파이로리는 A 형 간염 바이러스와 두 noroviruses은을 사용하여 병원체 인간 IgG의 타액 2-4 IgA와 IgG의 3,4- 및 2,3- 플라즈마 항체 반응을 측정하는 데 사용했다비드 기반 다중 면역. 물, 토양 및 식품 미생물에 노출 역학적 연구와 함께 사용될 때, 본 연구에 기재된 분석의 유형은 환경 병원체에 의한 감염에 대한 이해를 향상시키기 위해 중요한 정보를 제공 할 수있다. 또한, 이러한 연구에서 수득 타액 항체 데이터는 위험 평가 모델 19-22을 향상 시키는데 사용될 수있다.
Protocol
승인 (IRB # 08-1844, 노스 캐롤라이나, 채플 힐, 노스 캐롤라이나, 미국의 대학) 케론 비치, 푸에르토 리코,에서 beachgoers에서 자극 열구 타액 샘플의 수집에 대한 미국의 일환으로 임상 시험 심사위원회로부터 얻은 것 환경 보호청 (USEPA) 국립 역학 및 레크리에이션 (NEEAR) 물 연구 (23)의 환경 평가 수영 관련된 노출과 질병을 평가합니다. 연구 주제는 동의를 제공하고 훈련 USEPA 계약에 의해 타액…
Representative Results
고유 한 비드 세트 다양성을 샘플링 비특이적 결합을 측정하기 위해 제어 및 시료로 하였다. 이러한 비드가 결합 단계에있는 항원과 함께 배양하지 않은 것을 제외하고는 항원 결합 비즈와 동일하게 처리 하였다. 상기 혈청에서 의심 오염으로 인해 분석하고, 나머지 응답은 분산 로그 된 모든 타액 샘플과 함께 배양 제어 비드에서 얻은 MFI 값> (500)는 제거되었다. 잇몸이…
Discussion
이러한 결과는 멀티 플렉스 면역 방법은 면역 양성 또는 immunonegative 있습니다 타액 샘플을 구별하는 데 유용 있음을 나타냅니다. 의 면역 반응을 결정하기 위해, 하나의 차단 점 평균 플러스 타액 샘플 모두에서 테스트 제어 비결 비드 로그 변환 MFI 응답의 세 개의 표준 편차를 계산하여 개발되었다. 컷 – 오프 포인트는 단일 또는 다수의 병원체에 노출 immunoprevalence을 평가하는 능력을 수득 하였다….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
Referencias
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Citar este artículo
Augustine, S. A. J., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K. D., Plunkett, T. R. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).