투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기
Summary
여기서, 케 라티노 사이트에 Streptolysin S, 그룹 A 연쇄상 구균에 의해 생성되는 독소 분비 효과를 연구하기 위해 투과성 막 삽입 계 감염 시스템을 사용하는 방법을 설명한다. 이 시스템은 용이하게 감염 동안 각종 숙주 세포 유형에서 다른 박테리아 분비 단백질의 연구에 적용 할 수있다.
Abstract
대부분의 세균성 병원균 강력한 독소는 숙주 세포에서의 신호 변화를 개시하거나 감염 과정 동안 면역계 반응을 조작 숙주 조직의 파괴를 도움 분비. 방법이 성공적으로 정화하기 위해 개발이 중요한 독성 인자를 많이 생산되고 있지만, 여전히 그 독특한 구조 또는 광범위한 번역 후 변형 정화 및 체외 시스템에서 공부하기가 어려워 많은 박테리아 독소가 있습니다. 또한, 순수한 독소를 얻을 수있다하더라도, 중요한 생리 학적 조건하에 독소의 구체적인 효과를 연구와 관련된 많은 문제점이있다. 숙주 세포에서 분비되는 박테리아 독소의 효과를 평가하기위한 시험관 내 세포 배양 모델에서 대부분 독소 일회 투여로 숙주 세포를 배양 포함한다. 이러한 방법은 불완전 독소 지속적으로 생성되는 감염 동안 실제로 어떤 숙주 세포 경험 근사균체 및 감염 과정 동안 점진적으로 축적시켰다. 이 프로토콜은 인간의 상피 각질 세포에 Streptolysin S, 그룹 A 연쇄상 구균에 의해 생성 된 강력한 독소의 효과를 연구하기 위해 투과성 막 삽입 기 세균 감염 시스템의 설계를 설명한다. 이 시스템은 더 가깝게 순수 독소 나 세균 상층 액을 직접 숙주 세포에 적용하는 방법보다 감염시 자연 생리적 환경을 모방. 중요한 것은,이 방법은 또한 박테리아와 숙주 세포 사이의 접촉을 지시하기 때문이다 숙주 반응의 바이어스를 제거한다. 이 시스템은 호스트 효과적으로 막을 무결성 세포 생존율 및 세포 시그널링에 응답 Streptolysin S (SLS)의 효과를 평가하기 위해 이용되고있다. 이러한 기술은 용이하게 분비되는 박테리아 인수 D의 특정 역할을 조사하기 위해 포유 동물 숙주 세포 유형의 다양한 다른 분비 독성 인자의 연구에 적용 할 수있다감염 과정 uring.
Introduction
숙주 세포 감염의 맥락에서 박테리아 독성 인자의 기능을 이해 세균성 병인 연구의 주요 초점이다. 10 – 많은 세균 병원체 적극적 숙주 세포에서의 신호 변화를 개시하거나 감염 한 과정에서 면역계의 반응을 조작 숙주 조직의 파괴를 도움 독소 및 기타 가용성 인자를 분비한다. 방법이 성공적으로 정화하기 위해 개발 및 연구를위한이 중요한 독성 인자를 많이 생산되고 있지만, 일부 박테리아 제품은 체외 시스템에서 사용하는 격리에서 공부 할 수 없습니다, 따라서 정제 방법에 대한 그들을 완강히 저항하는 후보를 만들어 독특한 구조 나 광범위한 번역 후 변형이 . 예를 들어, 그룹 A 스트렙토 코커스, 인두염에서 괴사 성 근막염 독성 쇼크 증후군 감염에 이르는 수많은 책임이있는 세균 병원체, 분비 생산17 – Streptolysin S (SLS) (11)로 알려진 박테리아 독소. 이 ribosomally 생성 펩티드는 Streptolysin S 관련된 유전자 (처짐) 클러스터에 의해 인코딩되고, 성숙한 제품은 크기 14 kDa의 2.7을 추정된다 – 17. 17 – 사가로 인코딩 된 독소 (protoxin)는, 성숙, 함수 형태 (15)을 생산하는 여러 효소 (SagB, SagC 및 SAGD)로 번역 후 변형된다. 독소의 특이 아미노산 서열과 결합 된 이러한 번역 후 변형의 복잡성 15,17 데이트 시도 된 모든 정제 및 구조 해명 노력과 호환 독소 렌더링있다. 이 문제는 호스트의 발병 기전에서이 독소의 구체적인 역할을 결정하기 위해 복잡한 노력이 있습니다.
정제 된 독소 또는 다른 분비 요인의 준비가 가능 복잡하거나하지 중 하나 인 경우에 메커니즘에서20 – 이들 제품의 기능은 전통적으로 한 다음 셀 (18)을 호스팅인가 여과 세균 상층 액의 제조를 통해 연구되었다 명료. 이 기술과 관련된 여러 가지 문제가 있습니다. 저장하고 나중에 숙주 세포에 적용 첫째, SLS 포함이 분비 요인의 대부분은 최대 또는 일관된 활동을 유지하지 않습니다. 상청액은 단일 시점에 수집 한 후 숙주 세포에 적용되는 경우 또한, 그 생리 학적 관련성을 결정하기 위해 분비 인자는에 감염 과정에서 축적 할 수있는 자연적인 감염 과정에 대해 직접적인 결론을 도출하기 어려운 생리 학적으로 관련 농도. 3,8 -이 두 번째 도전은 세균 상층 액의 사용뿐만 아니라 숙주 세포 연구 1에서 정제 된 독소의 사용뿐만 아니라 적용됩니다. 이러한 문제를, 투석막을 INSE를 해결RT 계 감염 시스템은 최적의 독소 활성을 유지하고, 또한 박테리아 및 숙주 세포 간의 직접적인 접촉의 변수를 제거하는 방법으로 숙주 세포에서 SLS의 효과를 평가하기 위해 개발되어왔다. 이 시스템에서, 인간 상피 세포가 아니라 두 개의 챔버의 하부 챔버 내에서 단층으로 성장하고, 박테리아 같은 웰의 상부 챔버로 도입된다. 다공질 막 (0.4 ㎛의 세공) 분비 인자는 두 챔버 사이에서 교환 될 수있게하지만, 박테리아의 흐름을 방지하는 상부 및 하부 챔버를 분리한다. 이 시스템은 그룹 A 연쇄상 구균 감염시 직접 접촉을 통해 발생할 수있는 응답을 제거하면서 유일하게 지속 분비 세균의 구성 요소에 기인 호스트 응답의 효과 평가를 위해 허용했다. SLS 외에 다른 분비 세균 요인 또한 다공성 막을 통과 할 수 있지만, 야생형 (WT)를 포함하는 동종 돌연변이 패널의 사용, SLS-KNockout (ΔsagA)와 사가 보완 변형 (ΔsagA + 사가)를 엄격하게 SLS 의존 (21)이다 호스트 응답의 정확한 평가를 할 수 있습니다.
유사한 투과 막 삽입 시스템 분비 바이러스 감염에 관여하는 인자의 암 생물학 및 면역 세포 이동 (22)의 연구에 이용되었지만, – 숙주 세포와 세균의 상호 작용을 포함하는 26, 몇몇 연구이 방법 6,27,28을 이용했다. 세균과 숙주 세포 사이의 상호 작용을 탐구하는 이러한 시스템을 채용 한 경우에도 연구는 주로 투과 막 삽입에 도금 상피 또는 내피 세포 단층을 통해 염증 세포 또는 박테리아의 이동에 초점을 맞추고있다. 본원에 기재된 투과성 막 삽입 계 감염 시스템은 EFFE을 평가하는 다공성 막을 통해 박테리아 숙주 세포의 분리에 의존하는 간단하고 효과적인 방법숙주 막 무결성 세포 생존, 세포 신호 전달 및 분비 숙주 세포 인자의 분비 독소 SLS의 CTS. 이 방법은 감염 과정에 걸쳐 특정 박테리아 인자의 역할을 조사하기 위해 포유 동물 숙주 세포 유형의 다양한 다른 분비 독성 인자의 연구에 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 시험 관내 시스템에서 인간의 상피 각질 세포에 박테리아 독소 Streptolysin S의 효과를 조사하기 투석막 인서트 계 감염 시스템을 사용하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 다른 분비 박테리아 독성 인자의 연구뿐만 아니라 다른 숙주 세포 유형에 대해 적응 될 수있다. 3,8,18 – – (20)이 최근에 개발 된 시스템은 정제 된 독소 또는 여과 박테리아 상층 액 1을 이용하여 실험 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 투과성 막 삽입 기반 시스템은 최대 독소 활성이 유지 될 수 있도록이 생성되는 세포로 유치 관련 박테리아 독소를 일정하게 유지 용량을 제공하고, 또한, 실험 사이의 일관성을 증가시킨다. 또한,이 시스템은 더 가깝게 감염이 진행 분비 인자는 시간이 지남에 따라 누적있게되고 elimi으로 생리적 조건을 모방임의의 특정 독소 농도를 선택 할 필요가이 없습하는 숙주 세포에 적용 할 수 있습니다. 연구자들은 관심 박테리아 인자 접촉 의존적으로 숙주 세포에 전달되는지 여부를 평가하기 위해 또한, 본 시스템은 의미를 제공하는 것이다. 접촉 의존성은 종종 접착 또는 부착 방지 시약의 사용을 통해 동질 결핍 돌연변이 세균의 발생을 통해 테스트된다. 여기에 설명 된 시스템은 보완 또는 이러한 기존의 방법을 대체 할 수있는 간단한 대안을 제공한다.
프로토콜의 섹션 5에 기술 된 테스트 애플리케이션 외에, 다른 애플리케이션은 쉽게 적응 될 수있는이 감염 시스템은 사이토킨 어레이 및 ELISA 분석을위한 시료의 컬렉션을 포함한다. 두 경우 모두, LDH 방출 분석에 대해 기재 한 것과 유사한 프로토콜을 따라야한다. 여기에 도시되지 않았지만,이 시스템을 효율적으로 숙주 세포 샘플을 수집하기 위해 사용되어왔다유동 세포 계측법에 의해 nalyzed. 본 출원에서, 투과 막 인서트 감염 기간 후의 제거하고, 세포를 세포 배양 배지를 제거하는 세정하고, 트립신은 분석을 위해 세포를 수집 할 수 있도록 적용된다. 이렇게하지 않으면 흐름 cytometer하여 정확한 셀 카운팅을 방해 할 수있는 접착 박테리아 숙주 세포로 이루어진 큰 응집체의 형성을 방지 할 수 있기 때문 숙주 세포에서 세균의 물리적 분리는이 애플리케이션에 특히 유용하다.
기존의 직접 감염 연구와 투과성 막 삽입 계 감염 실험의 결과를 비교했을 때 매우 일관된 호스트 응답이 관찰되었다하더라도, 이러한 숙주 반응의 반응 속도에 주목할만한 차이점은 21을 관찰 하였다. 예를 들어, 호스트 신호 및 멤브레인 기반의 세포 독성의 변화는 코르보다 투과 막 삽입 기반 감염 모델에서 발생하는 이상 30 % ~ 50 %을직접 감염 모델을 응답. 투과성 막 삽입 기반 시스템의 각 웰의 상부 및 하부 구획실에 적용되는 매체가 필요하기 때문에, 여기에서 설명 된 연구를 위해 개발 된 시스템은 잘 비교 당 직접 감염 모델은 이전에 사용 된 대응하는 총 배지 용적의 30 % 증가를 필요 21. 직접적인 접촉이 금지 될 때 세균 숙주 세포의 증가 된 거리와 결합 총 배지 용적의 차이는 아마 SLS가 숙주 세포에 도달하는 매체를 통해 확산 및 관찰 된 효과를 유도하는 데 걸리는 시간을 증가시킨다. 또한, 투과 막 삽입 기반 시스템은 세포 손상을 호스트에 기여할 가능성이 많은 가스 독성 인자를 제거한다; 이 시스템이 추가적인 요소의 부재는 또한 숙주 세포 사멸 및 직접 감염에 비하여 21 호스트 시그널링 이벤트의 개시의 지연에 기여할 것으로 예상된다. 이러한 요소가 고려되어야실험을 설계 할 때 기타 분비 박테리아 성분을 평가한다.
숙주 세포에서 분비 된 박테리아 인자의 효과를 테스트 권장 투과 막 삽입 계 감염 시스템의 어플리케이션마다 시점의 범위를 시험하기위한 가장 의미있는 조건을 식별한다. 이 조건이 관심있는 특정 독성 요소가 최적으로 성공적으로 그 효과를 관찰하기 위해 (특정 환경 신호에 응답하여 예를 들어, 로그 상, 정지상, 등) 생산 무엇에 따라 고려하는 것이 중요합니다. 호스트 시그널링 단백질의 변화를 평가 집중 실험에서는 SLS가 숙주 세포에 도달하는 시그널링 (21)을 변화를 유도하기에 충분한 양으로 제조 할 수 있도록 충분한 시간을 허용 시점을 선택하는 것이 필요했다. 동시에, 필요한 시그널링 호스트 변화의 평가는 이러한 효과가 C로, 종래 SLS 유도 막 permeabilization로 수행 될분석을 위해, 숙주 세포 용 해물의 컬렉션 omplicates. SLS에 의해 유도 된 세포 사멸 최적 몇 시간보고 시그널링 이벤트 (21)의 개시 이후에 모두 직접 투과 막 삽입 계 감염 모델에서 관찰 할 수있다. 또한, 관심있는 시점을 선택하는데, 이는 연구되고 박테리아 연구 기간 동안 상기 다공성 인서트 막을 투과 할 수없는 것을 보장하는 것이 중요하다. 연장 된 기간 동안 어떤 박테리아 성분의 제조는 막 완전성을 파괴 및 하부 구획실에 박테리아의 통과를 허용 할 수있다. 이러한 관심의 시스템에서 잠재적 인 문제인지 여부를 결정하기 위해 조사되는 균주는 시점의 범위에서 투과 막 삽입 기반 시스템의 상부 챔버에 적용될 수있다. 각 시점에서, 삽입 조심스럽게 제거 될 수 있고, 하부 챔버로부터 배지를 수집하고, 표준 콜로니 공동으로 사용될 수있다unting 분석 (섹션 1.5 참조). 더 콜로니 하부 구획에서 세포 배양 배지로 형성되지 않으면, 삽입 막을 효과적으로 테스트 시점 세균 부하에서 박테리아의 통과를 방지하는 것으로 간주 될 수있다.
박테리아 분비 인자의 효과적인 분석을 위해 최적화를 필요로 할 가능성이있는 다른 실험 설계 요소 감염 (MOI)의 다양성이다. MOI는 숙주 세포 당 세균 세포의 비율을 의미하며, 따라서 감염시 박테리아 집락 형성 단위의 수 (CFU)가 숙주 세포의 생장에 영향을 셀에인가된다. 이러한 연구에서, 각질 세포는 이러한 세포를 그대로 견고 연접과 응집력 단층을 형성 할 수 90 % 컨 플루 언시까지 성장시켰다. 연구하고자하는 숙주 세포의 생체 조직에의 배려 감염 실험에 적합한 포화 상태를 선택하는 것이 필요하다. appropr 번웰 당 판정 숙주 세포 늦었 수가 적합한 박테리아 CFU 산출 목적 MOI를 기반으로 할 수있다. 여기에 설명 된 연구에서, GAS 다른 박테리아 원하는 후속 분석에 따라 달라질 적절한 MOI 10의 MOI에서 숙주 세포에 적용 하였다. 낮은 시작 MOI는 일반적으로 더 생리 학적으로 관련 및 분명하다 숙주 세포의 생존에 극적인 변화하기 전에 숙주 세포 신호 전달의 미묘한 변화를 포착 할 천천히 충분히 축적 관심의 세균 계수 수 있습니다. 높은 MOIs는 세포 독성을 평가하는 많은 연구에 사용되지만,이 효과는 낮은 MOI로 시작 감염 긴 시간 동안 진행하게함으로써 달성 될 수있다. 모든 균주가 테스트 될 때까지 동종 변이체는 야생형 박테리아에 비해 변경된 성장을 지닐 수 있으므로, 광학 밀도가 필연적으로 정확한 CFU를 결정하는 것이 중요하고, 따라서 더 높거나 낮은 CFU가 웰 당 첨가 할 것을 요구할 수있다균주의 숙주 반응의 적절한 비교를 보장한다. 연구되는 포유 동물 숙주 세포는 세균을 죽이거나 그 성장을 억제 또는 균주 간의 비동기 성장이 의심되는 경우, 또한 감염 기간의 끝에 최종 세균 부하를 평가하기 위해 연구를 수행하는 것이 유용 할 수 할 수있는 경우. 이는 투과 인서트의 내용을 수집하는 절차의 섹션 1.5에서 설명 된 것과 유사한 콜로니 계수 분석을 수행함으로써 달성 될 수있다.
원하는 분석을 위해 적절한 크기의 웰을 선택하면 최적의 결과를 얻기 위해 중요하다. 투과 막 삽입은 다양한 크기에서 사용할 수 있지만 여기에 표시된 연구를위한 가장 일관된 결과 24 잘 6 잘 조직 배양 플레이트 용으로 설계된 인서트를 사용하여 관찰 하였다. 이 인서트 크기는 멸균 집게로 처리하기가 비교적 용이하고, 조작의 용이성 방지에 중요하다우물의 아래 칸에 상부 구획에서 박테리아의 불필요한 전송을 보내고. 숙주 세포 용 해물의 컬렉션을 포함하는 실험을 위해, 6 잘 요리는 대부분의 분석을위한 조건에 따라 적절한 세포 수를 제공하고 샘플 수집을위한 세포 스크레이퍼를 수용 할 수있을만큼 크다. 숙주 세포가 접착을 유지하고 (예를 들어, 에티 디움 호모 다이머 분석, 트립 판 블루 배제 분석법)를 플레이트 판독기로 측정 할 수있는 형광 colorometric 염료로 표지 된 세포 독성 분석에 대해 해당 인서트있는 24 웰 플레이트의 사용은 좋습니다. 세포 배양 배지를 수집하고 분석한다되는 실험 (예 LDH 방출 사이토 카인 연구) 용 중 24 작은 우물 일반적 이러한 분석에 적합한 양의 샘플을 제공하고 필요한의 사용을 최소화하지만 웰 또는 6 웰 플레이트가 사용될 수있다 시약. 전반적으로,이 방법은 다용도이며 SAMPL을 제조하기 위해 필요에 따라 적응 될 수있다수많은 후속 응용 프로그램 말이지.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.
Materials
| Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
| Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
| HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
| 10cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
| 6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| 24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
| Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
| Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
| Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
| Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
| Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
| Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
| Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
| Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500mL | |
| Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
| LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
| Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
| DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
| Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
| Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |
Referencias
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