Le tri de flux et le séquençage Exome des cellules de Reed-Sternberg du lymphome de Hodgkin classique
Summary
Ici, nous décrivons un protocole de calcul de la cellule de cytométrie à flux combiné et un protocole de construction de bibliothèque de prochaine génération conçu pour produire des données de haute qualité et exhaustives des cellules Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) du lymphome de Hodgkin classique (CHL).
Abstract
Les cellules Hodgkin Reed-Sternberg du lymphome de Hodgkin classique sont dispersées dans un fond de lymphocytes inflammatoires et comprennent généralement moins de 1% de la masse tumorale. Les matières dérivées de la tumeur en vrac contiennent une teneur en tumeur à une concentration insuffisante pour la caractérisation. Par conséquent, le tri cellulaire activé par fluorescence utilisant huit anticorps, ainsi que des dispersions latérales et antérieures, est décrit ici comme une méthode de séparation rapide et de concentration avec des milliers de cellules HRS à haute pureté de la tumeur pour une étude ultérieure. Dans le même temps, car les protocoles standard pour le séquençage exome nécessitent généralement 100-1 000 ng d'ADN d'entrée, ce qui est souvent trop élevé, même avec le tri de flux, nous fournissons également un protocole de construction de bibliothèque optimisé et à faible entrée capable de produire une qualité élevée Des données provenant de seulement 10 ng d'ADN d'entrée. Cette combinaison est capable de produire des bibliothèques de prochaine génération adaptées à la capture d'hybridation de tout-eXome appâts ou plus ciblés panneaux ciblés, comme désiré. Exome du séquençage des cellules HRS, comparées aux cellules T ou B intratumorales saines, peuvent identifier les altérations somatiques, y compris les mutations, les insertions et les suppressions, et les modifications des numéros de copies. Ces résultats expliquent la biologie moléculaire des cellules HRS et peuvent révéler des voies pour les traitements ciblés.
Introduction
Les progrès dans la génomique du cancer à la suite du séquençage de la prochaine génération ont conduit à des percées significatives dans l'identification des cibles thérapeutiques et dans le pronostic pour de nombreux néoplasmes hématologiques et non hématologiques. De nouvelles stratégies de traitement individualisées basées sur des modifications génomiques spécifiques sont rapidement introduites dans de nombreux types de tumeurs (examinés dans les références 1 , 2 ). Malgré des progrès significatifs dans la génomique des lymphomes, le génome des cellules HRS néoplasiques dans le lymphome Hodgkin classique (CHL) avait été sous-exploré. Les recherches ont été entravées par la pénurie de cellules HRS néoplasiques dans un micro-environnement réactif, ce qui rend difficile l'isolement des populations de cellules HRS purifiées 3 .
La méthode pour isoler des cellules HRS viables à partir de tumeurs primaires a été développée par Fromm et al. 4 ,La méthode utilise un cocktail à huit anticorps, composé de CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 et CD64, pour identifier de manière non équivoque les cellules HRS à partir d'une suspension de tumeur CHL. En utilisant cette méthodologie, nous Sont capables d'isoler au moins 1 000 cellules HRS viables à partir de suspensions cellulaires fraîches ou congelées à partir de biopsies tumorales constituées d'au moins 10 cellules (environ 10 mg de tissu). La pureté est supérieure à 90% par analyse cytométrique en flux et est estimée comme étant Au moins 80% par une analyse génomique exome de dix cas consécutifs.
Nous avons raffiné une technique d'isolement de cellules cytométriques en flux qui a considérablement facilité le processus, ce qui permet l'isolement rapide de milliers de cellules HRS viables à partir de tumeurs CHL primaires 7 . Nous avons utilisé la technique pour produire ce qui est censé être la première séquence complète des cellules tumorales dans les cas primaires de lymphome de Hodgkin. Nos études démontrent queLa faisabilité des études à grande échelle sur le génome des cas individuels de la LCH et ont déjà conduit à l'identification de nouvelles altérations génomiques avec le potentiel d'expliquer les aspects de la pathogenèse de la LCH.
Nous avons développé un pipeline pour utiliser l'ADN extrait pour des études génomiques à haut débit. Afin d'obtenir des résultats fiables à partir de 1 000 cellules HRS triées (le minimum obtenu à partir de cas séquentiels), nous avons développé une procédure de construction de bibliothèque d'ADN de prochaine génération modifiée 8 qui nous a permis d'augmenter l'efficacité de ligature d'adaptateur et de générer des bibliothèques de fragments d'ADN Sans amplification excessive. Cette méthode permet l'analyse d'échantillons cliniques de routine et la détection de mutations récurrentes et d'altérations chromosomiques 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Applications ou directions futures après maîtriser cette technique
Ce travail permet un exoma de séquençage à partir d'échantillons contenant au moins 10 ng d'ADN. Dans le contexte clinique, cette limite exclut la plupart des échantillons d'aspiration à l'aiguille fine en raison d'un matériel insuffisant, mais comprend des biopsies de noyau adéquates et des échantillons de biopsie excisionnelle. Cela permettra l'acquisition de données à p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le développement de cette méthode de projet a été financé par le Département de pathologie et de médecine de laboratoire du Collège médical Weill Cornell. Nous reconnaissons le programme de formation tri-institutionnelle en biologie et médecine computationnelle pour un financement partiel. Nous tenons à remercier les scientifiques qui ont partagé leur temps et nos connaissances avec nous, en particulier Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; Et tous les membres du Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, y compris Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson et Tuo Zhang.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
Referencias
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