Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte
Summary
A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Abstract
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Introduction
Polymer – Mikroarrays sind Hochdurchsatz – Plattformen miniaturisierten , in dem bis zu 7.000 Polymeren 1 werden für Parallelanalyse mit prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen 2 auf Glasobjektträger gedruckt. Die hier vorgestellte Methode basiert auf dem , was wir zuerst 3 im Jahr 2010 beschrieben. Dieser Screening – System für zahlreiche Zelltypen , einschließlich humanen Hepatozyten 4, angewendet worden Stammzellen 5, renale tubuläre Epithelzellen 2, Bakterien 3,6 und Protozoen Erreger 7. In jedem Fall Polymere , die von den Zellen untersuchten Resists fördern oder Bindungs wurden 8 identifiziert. Komplexe von DNA mit synthetischen polykationischen Polymeren sind auch in der Microarray – Format für Hochdurchsatz – Screening von Kandidaten Gentransfektion 9 verwendet. Neben Screening für Zell-Substrat – Wechselwirkungen, Polymer – Mikroarrays haben auch zur Bewertung der Materialeigenschaften 10 verwendet.
"> Die Fähigkeit von synthetischen Polymeren Befestigung von Bakterien an eine Oberfläche zu modulieren ist gut 3,6,11 hergestellt. Eine Vielzahl von Faktoren einschließlich der Ladung, Hydrophobizität und die Oberflächenrauhigkeit der Polymeroberfläche sind bekannt bakterielle Bindung zu beeinflussen. Die herkömmlichen Ansätze des Entdeckens Biomaterialien die von Bakterien durch sequentielles Resists Bindung oder empirisch Auslegung und Prüfung eines Materials zu einem Zeitpunkt sind arbeitsintensiv, teuer und zeitraubende Prozesse. Polymer-Mikroarrays eine attraktive Alternative bieten für solche Einschränkungen zu umgehen.Oberflächen-assoziierten Bakterien wachsen, wie eine komplexe Population einen Biofilm genannt – solche Biofilme zu viele Umweltbelastungen und Antibiotika sehr resistent sind. Dies wird teilweise aufgrund ihrer dichten extrazellulären Matrix (bestehend aus Proteinen, Polysacchariden und Nukleinsäuren) 12 und durch die erhöhte Anwesenheit von robust "persistor" Zellen in Biofilmen 13 teilweise . Although die genauen Mechanismen der Oberflächen Vereinigungs- und anschließende Biofilmbildung schwierig zu charakterisieren, wird allgemein angenommen , dass es drei verschiedene Stufen der Oberflächenwachstum 14 – 16. Initiale, reversible Befestigung wird durch stärkere Adhäsion von Zellen gefolgt, die Einrichtung eines Biofilms durch die Produktion eines extrazellulären Protein und Polysaccharid-Matrix und Zellproliferation. Schließlich werden die reifen Biofilm Versionen freilebenden planktonischen Zellen, die an anderer Stelle neue Infektionen auslösen können. Bakterien abweisende Polymere, die die anfängliche Anlagerung von Bakterien zu verhindern, und somit frühen Stadien der Biofilmbildung zu verhindern, was möglicherweise eine ausgezeichnete Lösung dar Infektionen zu minimieren. Angesichts der Zunahme der Antibiotikaresistenz (und auch der an sich einen größeren Widerstand von oberflächen assoziierten Bakterien 12), antibiotikafreies Mittel von Infektionen zu reduzieren , sind von besonderem Interesse. In einem Krankenhaus, abstoßend Bakterien PolymerBeschichtungen können eine direkte medizinische Anwendung bei der Reduktion von nosokomialen Infektionen haben, die 17 um implantierte Vorrichtungen häufig bilden.
Hier wird ein Hochdurchsatz – Verfahren zum Screenen von 381 Polymeren für abweisende Wirkung gegen eine Reihe von pathogenen Bakterien mit nosokomialen Infektionen, gefolgt von Treffer Validierung und anschließende Beschichtung und Untersuchung von zentralvenösen Katheter Materialien wird beschrieben (Abbildung 1). Kurz gesagt, wurden die Polymere auf Agarose-beschichtete Glasobjektträger durch Kontaktdrucken und nach dem Trocknen und Sterilisieren getupft wurden die miniaturisierten Arrays mit klinisch wichtige Bakterienkulturen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikroarrays vorsichtig gewaschen und anhaftende Bakterienzellen wurden gefärbt und durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. Anschließend Polymere, die durch Elektronenmikroskopie durch Beschichtung auf Glasdeckplättchen in einem größeren Maßstab untersucht und visualisiert bakterielle Bindung inhibiert wurden. Ausgewählte abstoßenlieh Polymere wurden dann auf kommerziellen Katheter beschichtet und um fast 100-fach zu reduzieren Befestigung von Bakterien gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Befestigung von Bakterien an eine Oberfläche ist ein komplexer Prozess von einer Vielzahl von Faktoren abhängig von den Bakterienarten bestimmt, die Eigenschaften der Oberfläche des umgebenden Mediums und der physikalischen Umgebung. Obwohl bestimmte chemische Gruppen bakterielle Bindung zu beeinflussen sind bekannt (Polyglykole, beispielsweise widerstehen typischerweise Befestigungs 11), ist die biologische Wirkung von Polymeren mit ihren chemischen Strukturen Korrelieren schwierig, rationale Design von Polymeren für spezifische Funktionen anspruchs machen. In Abwesenheit von detaillierten Befestigungsmechanismen, haben andere Studien natürlich vorkommende abweisenden Oberflächen nachzuahmen versucht, mit langwierigen und umfangreichen Optimierungsprozesse 21. Die miniaturisierten Hochdurchsatzverfahren hier vorgestellten windet diese Herausforderungen durch parallele Screening von Hunderten von Polymeren zu erleichtern führt zur weiteren Untersuchung zu identifizieren.
Die Ergebnisse der Mikroarray-Verfahren hauptsächlich dazu dienen, identify wahrscheinlich Lead – Kandidaten dar. 2 22 Kandidaten mit geringer Bindung von mindestens einer Spezies zeigt, während 3 in Bindungskapazität die deutliche Reduktion demonstriert. Alle 22 Low-bindende Polymere in in Abbildung 2 gezeigt wurden , nach vorne in Scale-up Versuche gemacht, bei dem die beste (in Bezug auf Abweisung und Beschichtungseigenschaften) bestimmt PU83, PA13 und PA515 (4 und 5) zu sein. Polyacrylaten bieten eine größere Flexibilität bei der Polymerisation Methoden und so die niedrigste bindenden Polyacrylat, PA13, wurde für Katheter Beschichtungsstudien ausgewählt (6 und 7). Nähere weitere Arbeit wurde auf andere Kandidaten durchgeführt und an anderer Stelle 6 gemeldet.
Durch eine Reihe von experimentellen Wiederholungen fanden wir eine Reihe von kleineren Schritten zum Erfolg und Reproduzierbarkeit Schlüssel waren. Sowie erleichtern die Haftung desPolymere auf die Glasobjektträger, eine Agarose-under-Beschichtung sorgt für einen sauberen Hintergrund verwenden, wie Agarose sehr resistent gegen bakterielle Besiedlung ist. In ähnlicher Konsistenz in der Polymerflecken sich sowohl innerhalb der gleichen Anordnung und zwischen den Anordnungen, ist von entscheidender Bedeutung, und daher der Druck der Arrays müssen sorgfältig kontrolliert werden. Durch gezielte Einstellung der Stifte in den Druckkopf und auch eine gleichmäßige Befüllung der 384-Well-Platte erforderlich sind einheitliche Spek zu gewährleisten. Da einige der verwendeten Polymere wir ein gewisses Maß an Eigenfluoreszenz zeigten, Hintergrund Fluoreszenzdaten für jede Folie nehmen vor der Inkubation mit Bakterien lebenswichtig war. Zur Berücksichtigung Variationen und robusten Daten Replikate von Microarrays erhalten werden empfohlen.
Der Fleck verwendet hier (DAPI) keine Selektivität für Bakterienspezies, Bindung unspezifisch an DNA. Daher gute aseptische Technik ist wichtig, wenn Bakterienkulturen eingeführt werden als Verunreinigungen unbemerkt bleiben können, die Ausle verwirrendtation der Ergebnisse. Das gleiche gilt für spätere Experimente Rasterelektronenmikroskopie, wo es nur möglich ist, Stäbchen und Kokken zu unterscheiden, aber nicht Gattung oder Spezies.
Nach dem Microarray-Screening sollte viel versprechende Polymere für die weitere Validierung gewählt werden. Im hier vorgestellten Beispiel sieben Polymere von Interesse wurden durch ihre deutliche Reduktion der Fluoreszenz auf dem Mikroarray und deren Hemmung der Bindung identifiziert wurde durch Beschichten sie auf größeren Flächen bestätigt. 4 und 5 zeigen die Reduzierung auf Glasplättchen erreicht Bindung, ein praktisches Mittel, das Verhalten der Polymeren als bulk Beschichtungen nicht als Microarray-Spots zu testen. Anschließend wurden diese Polymere auf medizinische Vorrichtungen beschichtet zur vollständigen Reduktion der Bakterienbefestigungs quantifizieren. Es ist wichtig, dass das Lösungsmittel für diesen Beschichtungs Studien (siehe Abschnitt 8-Protokoll) ausgewählt ist gutartig auf das gewünschte Substrat (hier den Katheter), während behaltening Fähigkeit, das Polymer von Interesse, um zu ermöglichen Beschichtung aufzulösen. Hier haben wir Aceton, die, wie auch die genannten Eigenschaften, einen niedrigen Siedepunkt hat und verdunstet schnell eine gleichmäßige Beschichtung zu verlassen.
Die Mittel zur Validierung ausgewählt wird von der spezifischen Anwendung abhängen, untersucht. Als Beobachtung der Zellen durch Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie direkte Quantifizierung einzelner Zellanheftung kann, wählten wir diese Techniken als Ergänzung zu der Masse-Färbung Microarray-Assay. Die Ergebnisse sind in den 6 und 7 gezeigt , die die Bedeutung von komplementären Validierungsmethoden nachweisen. Die konfokale Bilder in Abbildung 6 liefern eine sehr klare Bilder der einzelnen Zellen, während der SEM den zusätzlichen Vorteil, dass eine Bewertung der Oberfläche des Polymers, die hier glatt und einheitlich ist. Diese Verfahren werden durch das Sichtfeld der Mikroskope beschränkt verwendet, und daher ist es important eine Reihe von Momentaufnahmen zu machen Vertrauen in die Ergebnisse zu haben. Das oben beschriebene Verfahren kann nicht bakterielle Adhärenz über die gesamte Oberfläche zu quantifizieren, nur Abdeckung aus einer Anzahl kleiner Regionen schließen. Wir glauben, dass dies für die beschriebene Anwendung ausreichend ist. Reduktion der bakteriellen Bindung konnte durch Auflisten Oberfläche anhaftenden Bakterien auf dem gesamten beschichteten und unbeschichteten Katheter Stücke unter Verwendung von Methoden beurteilt werden , wie an anderer Stelle 22 beschrieben. Jedoch erfordern solche Verfahren die Biomaterialoberflächen gesiebt, um eine gleichmäßige Oberfläche aufweist, die nur schwer zu erhalten, wenn Assays mit medizinischen Geräten durchgeführt werden, die oft komplexe Geometrie aufweisen.
Natürlich muss jedes Gerät für den klinischen Gebrauch bestimmt gehen durch erhebliche weitere Prüfung der Sicherheit und Wirksamkeit beim Menschen zu gewährleisten. Die hier vorgestellte Methode stellt den Beginn dieses Prozesses und die weitere Arbeit muss Bestätigung der de – vivo – Aktivität umfassen. In diesem Fall studieren venösen catheters, erste Arbeiten konnte die Bindung von Blutbestandteilen und ganzen Zellen an das Polymer zu untersuchen. Die Wirkung von Blutkomponenten auf die bakterielle Bindungs sollte auch in Betracht gezogen werden, möglicherweise durch die Bindungstests in Gegenwart von inaktivierten Serum wiederholende oder de-fibrinated Blut 23. Der endgültige Test der Technologie wird in einem in vivo – Modell sein, wie ein subkutanes Implantat Infektionsmodell 24.
Wir demonstrieren das Potential des Polymermikroarray-Verfahren zum Screenen von oberflächenverändernden Polymere. Solche Polymere (sowohl Widerstand und bakterielle Bindung zu fördern) haben eine große Anzahl von Anwendungen in der Medizin, der Lebensmittelindustrie und Biotechnologie, diese Methode Sinn nützlich sein können, in vielen Bereichen der Forschung. Obwohl hier die Arbeit Bakterien verwendet, könnte das Verfahren auf andere Zelltypen, und ebenso anderen chemischen Mikroarrays angepasst werden.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Materials
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
Referencias
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