Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

1. Préparation des lames Agarose Coated REMARQUE: avant la fabrication des puces à ADN de polymère, des lames de verre revêtues aminoalkylsilane sont revêtues d'agarose IB pour minimiser la liaison de fond non spécifique et permettre une évaluation des polymères qui se lient ou se repoussent les bactéries 6. revêtement Silane facilite la liaison d'agarose aux diapositives. Constituer une solution à 2% d'agarose IB dans de l'eau distillée dans une bouteille de 250 ml (p / v). Après coiffage la bouteille lâche, chauffer la suspension dans un four à micro-ondes dans les 30 périodes sec jusqu'à dissolution. Assurez-vous que le bouchon ne soit pas bien fermé pour éviter tout risque de pression accumulation. Retirez la bouteille régulièrement et agiter doucement. Veiller à ce que le solide soit dissous et la solution est claire. Versez cette solution d'agarose dans un bécher de 100 ml, et le placer dans un bain-marie à 65 ° C pour maintenir une solution liquide. Plonger les lames de silane enrobées dans la solution d'agarose, assurant un revêtement uniforme, et wipe le dos de la lame avec un mouchoir en papier. Sécher les lames, avec le côté revêtu haut, dans un environnement exempt de poussière (par exemple, à l' intérieur d' une armoire ou hotte) pour un minimum de 24 heures. Confirmer un revêtement uniforme par inspection visuelle. Revêtement peut être facilement évaluée par la respiration sur la lame – la condensation se forme sur les régions non revêtues. Seules les lames revêtues entièrement et uniformément devraient être utilisés pour l'impression de biopuces. 2. Préparation des solutions de polymères pour l'impression Préparer des solutions (1% p / v) d'une sélection de polymères préformés , comprenant des polyacrylates, des Polyacrylamides et des polyuréthannes dans de la N – méthylpyrrolidone (NMP) dans des flacons en verre. (Préparer 1 ml de chaque polymère). Vortex jusqu'à ce que le polymère est complètement dissous. Synthèse de polymères est décrit ailleurs 6. L'utilisation d'un micro-pipette, remplir chaque puits d'une plaque à 384 micropuits avec une solution de polymère de 25 pi, assurant qu'il n'y a pas de croix contamination et chaque puits contient un polymère unique. Utiliser la NMP comme témoin négatif dans au moins 2 puits. Noter l'identité de solution de polymère dans chaque puits sur un fichier et de modèle de plaque ou feuille de calcul. 3. Impression de polymère Microarrays Utilisation d'un contact imprimante REMARQUE: L'impression de biopuces a été réalisée en utilisant une imprimante de contact. Des instructions spécifiques concernant l'impression de microréseau de polymère sont donnés ci-dessous. Pour obtenir des directives générales sur l'utilisation des recommandations de l'imprimante et de sécurité, suivez le mode d'emploi du fabricant. Même si on utilise une imprimante de contact, un dispositif d'emboutissage manuel approprié pourrait également être utilisé. Comme indiqué dans le mode d'emploi de l'imprimante, créer une routine (voir l'étape 3.3) qui permet l'impression de 384 liquides (les solutions de polymères ou NMP) en quatre exemplaires, en utilisant une tête de microréseau 32 broches (disposées comme 8 lignes et 4 colonnes). Imprimer 1.536 points disposés en 48 rangées et 32 ​​colonnes. Programmer la routine pour imprimer en 12 sections, ie., 32 solutions à la fois, de sorte que l'imprimante peut être arrêtée après l' impression de chaque section pour permettre le nettoyage de broches. Pour créer une routine d'impression: Ouvrez le logiciel et les options disponibles choisissent «Créer une nouvelle routine. Sélectionnez l'onglet «Description» aux détails d'entrée de l'expérience. Sélectionnez l'onglet 'Head' et choisissez '32 -pin tête de microréseau. Sélectionnez l'onglet 'Source' et choisissez support de plaque (support de plaque de source (1×5)), le type de plaque (plaque 384 x 6000), plaques totales (1) et de l'ordre de source (par des colonnes). Dans l'onglet 'Slide design', choisissez '3×1' 'slide' et choisissez par rangeant 'Numéro de champ'. Ensuite, sélectionnez «motif de formation de réseau». Entrée 'Vue Spot' comme «mise en page» et «dimensions Pattern» comme «Nombre de lignes» (6), «Nombre de colonnes» (8), «pitch Row» (750) et «pas Colonne» (560). Choisissez une section à imprimer sapinst. Dans le 'Slide layout' entrée onglet le nombre de diapositives utilisé pour l'impression. Sélectionnez l'onglet 'Imprimer' pour saisir les paramètres d'impression (nombre de timbres par encrage: 1, nombre de timbres par point: 5, horodatage: 200 msec, le temps d'encrage: 100 msec). NOTE: Une routine est maintenant créé pour l'impression de 384 liquides (les solutions de polymères ou NMP) en quatre exemplaires, en utilisant une tête de microréseau 32 broches (disposées comme 8 lignes et 4 colonnes). Au total, la routine doit imprimer 1.536 points disposés en 48 lignes et 32 ​​colonnes avec un pas de ligne de 750 um et la hauteur de la colonne de 560 um. Placer les lames d'agarose revêtues sur la plate-forme et d'assurer une bonne étanchéité de vide pour maintenir les lames en position. Ajustez la tête d'impression de telle sorte que toutes les broches sont à la même hauteur. Vérifiez ceci en abaissant manuellement la tête sur une lame de verre et de confirmer que les broches se déplacent en même temps. S'il y a des divergences avec la hauteur, régler en utilisant le sleeve sur la tige vers le haut ou vers le bas. Placer la plaque de puits sur le support de plaque dans le bon sens, à savoir., Bien A1 est en haut à droite du support et assurer la plaque bien est fixé fermement. À l'aide du dispositif de réglage en hauteur, en sorte que la hauteur du support de plaque est telle que lors de la cueillette des solutions de polymères, les broches ne touchent pas le fond des puits. NOTE: Ceci est important pour les taches de polymère uniforme et aussi pour éviter de renverser des solutions de polymères dans des puits adjacents, provoquant ainsi la contamination croisée. Sélectionnez l'onglet «Démarrer» et choisissez «type Run» comme «normale». Cliquez sur "Exécuter", et confirmer cette diapositive, bien plaque, etc., sont en position lorsque vous êtes invité. Imprimer 1 section à la fois (32 solutions à la fois; 12 sections), permettant le nettoyage des broches entre les sections. Nettoyez les broches à fond avec une serviette en papier trempé dans de l'acétone, suivie par du papier de soie sèche pour assurer les broches sont complètement sec. A la fin de l'impression des microarrays, placez-les dans un support de diapositives et les sécher pendant la nuit dans une étuve sous vide réglée à 45 ° C pour éliminer le NMP dans les points de polymère. Après stérilisation à la lumière UV pendant 30 minutes, les microréseaux sont prêts pour l'inoculation des bactéries. Avant inoculant diapositives avec des bactéries, de prendre une mesure de fluorescence de fond (comme décrit dans la section 5). Utiliser cette mesure dans le calcul de la liaison bactérienne. 4. Ensemencement des polymères microarrays avec des bactéries REMARQUE: Veiller à une bonne technique aseptique. Toutes les manipulations des cultures doit être réalisée dans un environnement stérile: soit à l'aide d'un brûleur Bunsen ou dans une hotte à flux. Les cultures doivent être cultivées avec la disponibilité de l'oxygène, le milieu de croissance, et la température ajustée aux exigences de chaque espèce. Préparer cultures d'une nuit en inoculant 5 ml Luria-Bertani bouillon (LB: 10 g L -1 bactotryptone, 5 g L -1 NaCl et 10 g L <sup> -1 extrait de levure) avec une colonie d'une plaque. Incuber une nuit à 37 ° C, en agitant à 200 tours par minute. Préparer les stocks de congélation des cultures d'une nuit par addition de glycérol (10% concentration globale) et stocker le stock à -80 ° C. Afin de déterminer le nombre de cellules à partir d'échantillons des souches bactériennes décongelés, effectuer des dilutions en série de chaque stock et faire croître les bactéries pendant la nuit sur des supports solides. La détermination précise du nombre de cellules dans les stocks assure l' inoculation appropriée de chaque espèce 6. Pour préparer des inoculums microréseau. cultures monospécifiques sont cultivées comme ci-dessus et appliqués directement sur les microréseaux. BacMix-1 est un mélange bactérien de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), et Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 est un mélange de bactéries constitué par Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus </em>, K. pneumoniae et Enterococcus faecalis (E. faecalis). Pour produire soit une culture mixte, mélanger overnights en volumes égaux (3 ml chacun) et diluer quatre fois avec LB frais (à environ 50 ml de volume final). Placez microarrays de polymère stérilisé aux rayons UV dans des plaques 4 puits rectangulaires et les incuber avec 6 ml de cultures bactériennes mixtes à 37 ° C avec une légère agitation (30 rpm) pendant 5 jours. Après incubation, rincer doucement les microréseaux deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS: NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4) et on incube avec une solution de 1 pg ml – 1 de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) tache dans du PBS pendant 30 min. Laver les lames microarray colorées dans une plaque de puits fraîche en couvrant avec du PBS et remuant doucement, en changeant le PBS une fois. Sec sous un courant d'air. Appliquer une lamelle de verre à la diapositive de microréseaux et le joint en place avec de la colle. Une fois dry, stériliser la surface extérieure avec 70% (v / v) d'éthanol. Mettez au rebut des cultures en fonction de leur niveau de confinement. 5. Microarray Imaging and Analysis Capture d'images individuelles pour chaque tache polymère clair et DAPI (/ Em = 358 nm / 361 nm Ex) canaux. Effectuer cette opération manuellement avec un microscope à fluorescence ou à l'aide d'un microscope à fluorescence automatisée (avec une platine XYZ commandé par un logiciel d'acquisition d'image) équipé d'un objectif 20X. REMARQUE: Se reporter au manuel 18 pour faire fonctionner le logiciel et le réglage du microscope pour obtenir des images en utilisant des canaux de fond clair et DAPI. Assurez-vous que le gain et le temps d'exposition pour la capture d'image pour tous les microarrays sont les mêmes. Obtenir l'intensité de fluorescence moyenne de chaque spot dans le canal DAPI en choisissant la zone spot et la quantification de la fluorescence avec un logiciel de traitement d'image. Pour la fluorescence de chaque tache de fond, bénéficier du droitdans les images des points de polymère sur un microréseau répliquée incubé seulement avec les médias sans bactéries. Déduire la fluorescence de fond de l'intensité de la tache pour obtenir la fluorescence des bactéries. Calculer la valeur normalisée moyenne des quatre points, ce qui représente chaque polymère, utilisé pour comparer les bactéries de liaison de divers polymères 6. Identifier les polymères qui présentent la liaison (fluorescence la plus basse) moins bactérienne que les polymères «hit» 6. 6. Revêtement de la couverture Slips pour la validation 'Hit' Pour Lamelles Coat avec Polymers: Préparer des solutions de polymères «hit» (~ 2% p / v) dans du tétrahydrofurane (THF), ou un autre solvant approprié. revêtement par rotation des lamelles en verre circulaire de taille appropriée avec les solutions de polymères en utilisant une tournette à 2000 tours par minute pendant 10 s. NOTE: En l'absence d'une tournette, des lamelles ou d'autres matériaux peut être enduit par trempage, bien essoragele revêtement produit une surface plus uniforme. Sécher les lamelles enrobées dans un four à convection à 40 ° C pendant une nuit et stériliser à l'aide d'une lumière UV pendant 30 minutes avant l'inoculation des bactéries. Pour Lamelles Manteau avec Agarose pour les contrôles négatifs: Nettoyer les lamelles soit par traitement au plasma pendant 10 min ou immersion dans NaOH 1 M pendant 4 heures. Immerger les lamelles couvre-objet dans de l'acétonitrile contenant 1% (3-aminopropyl) triéthoxysilane pendant une nuit. Nettoyer les lamelles avec de l'acétone 3 fois et les mettre dans un four (100 ° C) pendant 1 heure. manteau de Dip Les lamelles séchées avec 1% solution aqueuse d'agarose maintenues dans un bain d'eau à 60 ° C. Placer les agarose revêtu des lamelles sur une surface plane dans des conditions ambiantes sans poussière pendant 24 h et stériliser en utilisant la lumière UV pendant 30 minutes avant de bactéries inoculer. 7. Fixation et analyse de la couverture Slip utilisant microscope électronique à balayage (MEB) Aprèsla stérilisation à la lumière UV pendant 30 minutes, placez les lamelles (polymère / verre agarose revêtu ou non) dans une plaque de 12 puits standard ou plaque de 24 puits (en fonction de la taille des lamelles) et incuber avec des bactéries comme décrit dans la section 4. Après incubation avec des bactéries, se laver les lamelles couchés et non couchés à deux reprises avec 0,1 M de tampon cacodylate (pH 7,4), puis fixer avec 2,5% (p / v) de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,1 M (pH 7,4) pendant 2 heures. échantillons post-fixage avec 1% (p / v) de tétroxyde d'osmium pendant 1 h à température ambiante et on déshydrate avec des lavages successifs à l'éthanol à 50, 70, 90 et 100% (v / v) pendant 30 minutes chacune. Des échantillons secs de CO 2 selon les protocoles standards 19. Le temps de séchage dépendra de la nature de l'échantillon. échantillons de manteau dans un alliage or / palladium (60/40%) en utilisant une coucheuse par pulvérisation cathodique avec un courant à 30 mA et vide à 0,75 Torr. Examiner sous un microscope électronique , selon des protocoles standard 20. NOTE: Ensure mesures de sécurité adéquates pour gérer les risques résultant du stockage, la manipulation et l'élimination des Osmium tétraoxyde, car il est très toxique. comparer visuellement les images des lamelles non revêtues et celles revêtues d'agarose ou les polymères «hit» pour confirmer bactériennes capacités de liaison / répulsives des polymères. NOTE: La résistance de l'attachement doit être facilement visible comme une réduction des cellules présentes. Choisissez les plus prometteurs «hit» des polymères non contraignants pour les études de revêtement avec des dispositifs médicaux (par exemple, des cathéters veineux centraux) 6. 8. Sélection d'un solvant pour revêtement de cathéters Évaluer divers solvants pour leur compatibilité avec la partie inhabitation du cathéter, ainsi que leur capacité à dissoudre le polymère «hit». Coupez les parties de cath-1 et en morceaux cylindriques de 5 mm de longueur, et de mesurer avec un pied à coulisse numérique. Évaluer divers solvants tels que acetl' acide ique, l' ammoniac, l' acétone, l' acétonitrile, l' éther diéthylique, le tétrahydrofuranne (THF), le diméthylformamide (DMF), le N – méthyl-2-pyrrolidone (NMP), l' éthanol, le méthanol, l' éthylène glycol, le toluène et le xylène. Immerger morceaux de cathéters dans les solvants pendant 12 heures et à évaluer visuellement l'intégrité du cathéter et la clarté du solvant. REMARQUE: Choisissez un solvant qui ne provoque pas les cathéters à gonfler ou se désintègrent ou se traduisent par un solvant turbide. Le solvant doit dissoudre les polymères «hit». 9. Analyse de la fixation des bactéries sur les cathéters par microscopie confocale Préparer 2,5% (p / v) des solutions de polymères dans de l'acétone ou un autre solvant approprié tel que déterminé dans la section 8. Placer 5 pièces mm de cathéter dans un petit flacon de verre (5 ml) et les plonger dans 1 ml de la solution de polymère pendant 2 min . Retirer la solution de polymère en excès et sécher les morceaux de cathéter pendant une nuit dans une étuve sous vide à 40 ° C. Préparer inoculum en mélangeant décongelé st bactériennetroupeaux pour donner environ 10 6 cellules de chaque espèce dans 50 ml LB 6. Stériliser morceaux de cathéter couchés et non couchés avec une lumière UV pendant 30 min et incuber avec 1 ml inoculées LB dans une plaque de 24 puits, à 37 ° C pendant 3 jours, avec agitation douce 6. Après incubation, laver les cathéters avec du PBS (2x, 2 ml), fixer les bactéries avec 10% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 30 min, et laver avec du PBS (1 ml). Colorer les bactéries sur des morceaux de cathéter avec du DAPI (1 pg ml – 1) pendant 20 minutes et on lave avec du PBS (1 ml). Obtenir des images confocale des pièces de cathéter en utilisant les paramètres suivants: 405nm bleu diode laser, plage de détecteur 414-502 nm, trou d'épingle – Airy1, l'image Taille – 1.024 × 1.024 pixels, largeur de voxel – 105,2 nm, Z-piles d'espacement 0.5μ m , grossissement – 40X 1,25. Terminez l'imagerie confocale par Z-empilement 50 images à travers longueur de 100 um du cathéter. Analyser les images en utilisant suitabLe logiciel d'analyse: aplatir les images en Z empilée dans le plan Z, en utilisant la fonction pour étendre la profondeur de champ, pour créer une seule image d'une pièce de cathéter. NOTE: Cette image doit ensuite être analysé pour obtenir la zone du cathéter couverte par des bactéries, après correction d'arrière-plan en utilisant la fonction 'aplatir background'. 10. L'analyse de la fixation des bactéries sur les cathéters par SEM Préparer une solution à 10% de polymère (p / v) dans de l'acétone. Appuyez sur une pointe de pipette (pour 200 ul micropipette) dans la partie médiane de la pièce du cathéter de coupe pour le maintenir et tremper la pièce dans la solution de polymère pendant environ 30 secondes. Sécher la pièce revêtue dans des conditions ambiantes pendant 30 min. Appliquer un second revêtement par immersion à nouveau dans la solution de polymère et sécher pendant la nuit dans des conditions ambiantes. Après le traitement UV et une incubation avec des bactéries se laver les morceaux (n = 3) avec du PBS (2x 1 ml) et de les transférer dans des plaques à 48 puits contenant 10% de formaldehyde dans du PBS pendant 30 min. Après la fixation, se laver les morceaux avec du PBS (1 ml), sécher pendant la nuit à la température ambiante, monter sur les talons avec des disques de carbone conducteur, et le manteau d'or en utilisant une coucheuse de pulvérisation (voir l'étape 7.5). Obtenir des images en utilisant un microscope électronique à balayage 6.