Совокупный размер Оптимизация в Микролунки, для подвески на основе сердечной дифференциации человеческого плюрипотентные стволовые клетки

1. Подготовка компонентов среды Приготовьте промывочный Medium. На 100 мл DMEM / F12, прибавляют 1 мл 100х пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep), 1 мл 100x L-глутамина, и 5 мл замены сыворотки. Подготовьте химически определенную Базальная Сердечный индукционной среде в соответствии с инструкциями изготовителя. Подготовьте следующие акции реагенты для средств массовой информации, которые будут использоваться в данном протоколе. L-аскорбиновая кислота: Готовят раствор 5 мг на мл в 4 ° С, стерильный сверхчистой дистиллированной воды в конической трубе. Оставьте это решение на льду и вихревой трубки периодически, пока растворенное вещество полностью не растворится. Фильтр-стерилизовать Аскорбиновая кислотного раствора с помощью шприца 0,22 мкм фильтр. Подготовка 1 мл аликвоты раствора аскорбиновой кислоты и хранить эти аликвот при -20 ° С. Используйте свеже талой аликвоты готовят каждый раз, когда среда. В день средней подготовки, Развести 13 мкл монотиоглицерина (MTG) в 1 мл базальной кардиохирургии индукционной среде. Отбросить неиспользуемые, разбавленный MTG. Готовят аликвот объемом 1 мл трансферрина (30 мг / мл), чтобы хранить при -20 ° С. Хранить оттаивают аликвот при 4 ° С в течение 3-х месяцев. Готовят 4 мМ соляной кислоты (HCl), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). В вытяжном шкафу, добавляют 30 мкл 6,0 N раствора HCl в 50 мл сверхчистой дистиллированной воды. Фильтр-стерилизовать раствор с помощью шприца 0,22 мкм фильтр. Добавляют 2 мл 25% раствора БСА в растворе HCl в 50 мл. Готовят фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Добавьте 20 мкл 25% раствора БСА на мл PBS. Готовят кости человека морфогенетического белка 4 (BMP-4) маточного раствора (10 нг / мкл). Растворить 10 мкг лиофилизованных ВМР-4 в 1 мл раствора 4 мМ буфера HCl, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С. Приготовьте Человеческий фактор роста фибробластов 2 (bFGF) маточного раствора(10 нг / мкл). Растворить 10 мкг лиофилизированного bFGF в 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С. Приготовьте сосудистый эндотелиальный фактор роста человека (VEGF) маточного раствора (5 нг / мкл). Растворяют 5 мкг лиофилизированного СЭФР в 1 мл PBS, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С. Подготовка активин маточного раствора (10 нг / мкл). Растворить 10 мкг лиофилизованных активин А на 1 мл PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Готовят 50 мкл аликвоты для хранения при -20 ° С. Готовят Ингибитор Wnt Production-2 (IWP-2) маточного раствора (10 мМ). Растворите 2 мг ИВП-2 в 429 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Готовят 10 мкл аликвоты для хранения при -80 ° С. Подготовить полный Сердечный индукционной среде. К 100 мл базальной кардиохирургии индукционной среде, добавляют 1 мл 100x Pen / Strep 1 мл 100x L-глутамина, 500 мкл трансферрина, 1мл свежей талой аскорбиновой кислоты и 300 мкл MTG. Отбросить неиспользуемые среды. 2. Подготовка плиты Microwell Примечание: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности. Добавить 0,5 мл промывочным раствором (набор компонентов) в каждую лунку, которая будет использоваться на пластине. Для того, чтобы гарантировать, что раствор контактирует по всей поверхности внутри каждого микролунку, центрифугировать планшет при 840 х г в течение 2 мин. Инкубируйте планшет в течение 30 до 60 минут при комнатной температуре. Аспирируйте промывочным раствором из лунок. Промыть каждую лунку дважды следующим образом : Добавьте 1 мл PBS в каждую лунку, центрифуга планшет при 840 х г в течение 2 мин, а затем отсасывает PBS. 3. Формирование HPSC Агрегирует в пластине Microwell Примечание: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности. Поместите Wash среды в C водяной бане при 37 °. Примечание: Объем требуется = 1 мл х количество скважин НрСК, которые будут диссоциированы. Диссоциируют hPSCs в одиночных камерах Примечание: Эти шаги описывают диссоциации клеток, культивируемых на 6-луночные планшеты – объемы реагентов можно масштабировать пропорционально для различных форматов культуры. Аспирируйте культуральной среды из каждой культуры HPSC хорошо для диссоциации. Промыть каждую лунку с 1 мл диссоциации фермента, а затем сразу же аспирация диссоциации фермента из каждой лунки. Примечание: Остаточное диссоциации фермент должен быть достаточным, чтобы отделить клетки. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 3 мин. Добавить 1 мл промывочного среды в каждую лунку и механически диссоциируют клетки с поверхности для культивирования тканей с помощью пипетки при стирке среде с P1000 микропипетки над поверхностью для культуры ткани. Если диссоциация оказывается неполным и сгустки клеток остаются, проходят суспензии через сито в этой точке. Передачи клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл и храняттрубка в инкубаторе в то время как количество клеток выполняется в следующем шаге. Выполните подсчет клеток: Возьмите пробу 10 мкл суспензии клеток, собранных на предыдущем этапе. Добавьте 30 мкл трипанового синего и смешать суспензию хорошо пипеткой. Перенесите 10 мкл трипанового синего-окрашенных клеток в каждой камере гемоцитометра и визуализировать под инвертированным микроскопом с целью 10X. Граф клеток. Из результатов подсчета клеток, вычислить , сколько скважин могут быть посеяны на 1,2 × 10 6 клеток на лунку планшете. Подсчитайте Агрегирование среды, необходимой для семян клеток в количестве 1 мл на каждую лунку. Приготовьте агрегации среды. На 10 мл полной Cardiac индукционной среде, добавьте 0,5 мкл BMP4 исходного раствора (конечная концентрация = 0,5 нг / мл) и Y-27632 ROCK ингибитора (конечная концентрация = 10 мкМ). Удалите коническую пробирку, содержащую hPSCs из инкубатора и centrifuGE трубка при 200g в течение 5 мин. Аспирируйте промывочной среды и клетки вновь суспендируют в среде агрегации при плотности 1,2 × 10 6 клеток на мл. Аспирируйте промывочного раствора PBS из каждой лунки на планшете. Использование P1000 микропипетки, равномерно распределить и семенные 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку на планшете. Потомству большое количество скважин, периодически вихрь клеточной суспензии для предотвращения осаждения. Центрифуга пластину при 200g в течение 5 мин. Обратите внимание на пластину под микроскопом, чтобы подтвердить клетки отжимается в нижней части каждого микролунку. Инкубируйте планшет в течение 24 ч при 37 ° С в 5% СО 2, 5% O 2 (гипоксическая) инкубаторе. 4. Сердечная Индукция 1-й этап Один день после агрегации (1 день), подготовить необходимый объем Этап 1 индукционная среды (для 24-луночного планшета, объем = 1 мл х количество лунок). Для получения 1 мл полнойсердечный индукционной среде, добавить 1 мкл BMP4 исходного раствора (конечная концентрация = 10 нг / мл), 0,5 мкл bFGF исходного раствора (конечная концентрация = 5 нг / мл) и 0,6 мкл активин А (конечная концентрация = 6 нг / мл). Поместите среду в C водяной бане при 37 ° в течение не менее 15 мин. Удалите Микропланшетный из инкубатора. Осмотрите агрегаты под микроскопом. По сравнению с агрегацией сразу после центрифуге, они должны появиться нетронутыми с гладкими краями (более круглым и меньше площади, чем в предыдущий день). Удалить супернатант, не нарушая агрегатов внутри лунках: Удерживая Микропланшетный по горизонтали уровень (то есть., Не наклоняйте его). Для каждой лунки на планшете, поместите кончик P1000 микропипетки на поверхности культуральной среды и против края колодца. Медленно снимите среду, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить агрегаты в нижней части лунках. После уменьшения тон средний уровень приблизительно от 1 до 2 мм от текстурированной поверхности микропланештным, медленно наклонить пластину для сбора среды на одной стороне скважины (когда объем является достаточно низким, движение жидкости значительно снижается, и его легче избежать агрегатов получения поднятый из их индивидуальных лунках). Медленно пипетку из оставшейся среды в скважине. Чтобы добавить свежий Этап 1 индукционной среде, обеспечивая при этом агрегаты остаются в своих отдельных лунках: Draw 1 мл 1 этап индукционной среде с P1000 микропипетки. Удерживать наконечник пипетки на внутренней кромке колодца и очень медленно дозировать среды к внутренней стенке колодца. Повторите эти действия для остальных скважин. Возвращение пластины в инкубатор при гипоксических условиях в течение 3 -х дней. 5. Сердечная Индукция 2-й этап На 4-й день, место моют среду (объем = число скважин х 2 мл) в водяной бане при 37 ° C в течение минимум 15 мин. Подготовьте необходимый объем Этап 2 индукционной среде (объем = количество лунок × 1 мл): в мл полной сердечной индукционной среде, добавьте 2 мкл VEGF исходного раствора (конечная концентрация = 10 нг / мл) и 0,5 мкл ИВП-2 Исходный раствор (конечная концентрация = 5 мкМ). Поместите подготовленный Стадия 2 индукционные среды в водяной бане C 37 ° в течение как минимум 15 мин. С помощью 5 мл серологической пипеткой, собирают агрегаты из каждой лунки микропланшета пластины и собрать совокупную суспензию в 15 мл коническую трубку (получить до 10 скважин в 15 мл пробирку). Разрешить агрегаты обосноваться в течение 15 мин в гипоксического инкубаторе. Примечание: Этот шаг важен для разделения отдельных клеток и клеточных остатков из неповрежденных агрегатов. Тщательно Аспирируйте супернатант и ресуспендирования агрегатов в 10 мл подогретого промывочного среды для удаления остаточных индуктивные цитокины (например, активин А является мощным сигнальной молекулой , даже при очень низком сотрудничествеncentrations). Центрифуга агрегаты при 50 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют гранулированные агрегаты в подогретого Induction 2 средних. Перенести совокупный суспензии в 24-луночные сверхнизким крепление (ULA) пластины в количестве 1 мл на каждую лунку. Обратите внимание на агрегаты под микроскопом в форме, плотных клеточных кластеров. Инкубируйте в условиях гипоксии до 6 -й день. 6. Сердечная Индукция 3 этап На 6-й день, подготовить необходимый объем Этап 3 индукционной среде (объем = количество лунок × 1 мл). Для получения 1 мл полной Cardiac индукционной среде, добавьте 2 мкл СЭФР маточного раствора (конечная концентрация = 10 нг / мл) и 0,5 мкл bFGF исходного раствора (конечная концентрация = 5 нг / мл). Уготовано место Стадия 3 индукционную среду в водяной бане C 37 ° в течение как минимум 15 мин. С помощью 5 мл серологические пипетки для передачи заполнителей до 15 мл конические пробирки, объединяют до 10 мл агрегатныйна одной трубе. Разрешить 10 мин для агрегатов осесть. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования агрегатов в подогретого Этап 3 индукционной среде. С помощью 5 мл серологические пипетки, перераспределить агрегаты в пластину 24-луночного БАУ в количестве 1 мл на лунку. На 10-й день, подготовить необходимый объем Этап 3 индукционной среде (объем = количество лунок х 1 мл), как на шаге 6.1. С помощью 5 мл серологические пипетки для передачи заполнителей до 15 мл конические пробирки, объединяют до 10 мл на пробирку агрегатов. Разрешить 10 мин для агрегатов осесть. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования агрегаты на стадии 3 индукционной среде. С помощью 5 мл серологические пипетки, перераспределить агрегаты в пластину 24-луночного БАУ в количестве 1 мл на лунку. Инкубируют при гипоксических условиях в течение двух дней. На 12 -й день начинают инкубацию клеток при нормоксических уровней кислорода в течение оставшегося периода культивирования (37 ° C, 20% O 2, 5% СО 2). ЗАМЕТКА:После этого периода точки, клетки больше не культивируют в условиях гипоксии. Повторите эту полную среду обмена (этапы 6.2 и 6.3) каждые 4 дня, начинаясь 14-й день до сбора урожая клеток (как правило, пиковые концентрации кардиомиоцитов наблюдаются после того, как 14-й день дифференцировки). 7. Проточная цитометрия Анализ сердечного тропонина Т (cTnT) Выражение Частота Микропланшетная культуры Выход Диссоциируют агрегаты следующим образом: Используйте 5 мл серологические пипетки для передачи 1 скважины агрегатов в 15 мл коническую трубку. Центрифуга агрегатов при 50 мкг в течение 2 мин и тщательно аспирата супернатант. Добавляют 1 мл свеже растворенного раствора 1 мг / мл коллагеназы типа II для агрегатов. Перенести совокупную суспензию до 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Инкубируйте агрегатов в коллагеназы типа II в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день, используйте P1000 микропипетки осторожно диссоциируют агрегатыв гомогенную суспензии отдельных клеток. Если агрегаты не легко диссоциируют, располагаются агрегаты, аспирация супернатант и инкубировать агрегатов в 700 мкл разобщения фермента в течение от 1 до 2 мин при комнатной температуре. Аккуратно пипеткой агрегатов от 1 до 2 раз с P1000 микропипетки диссоциировать. Развести диссоциации фермента: Добавьте 700 мкл промывочного питательной среде, содержащей 14 мкл 1 мг / мл ДНКазы исходного раствора. Взять пробу 10 мкл для выполнения подсчета клеток, и центрифугировать Оставшуюся суспензию, используя стендовые микроцентрифужными при 300 х г в течение 2 мин. Выполните подсчет клеток: Пятно 10 мкл образца подсчета с равным объемом трипанового синего и считать с помощью гемоцитометра. Снимите трубку микроцентрифужных 1,5 мл, содержащую оставшиеся клетки из микроцентрифуге. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток, при концентрации от 200000 до 500000 клеток на 100 мкл, в Hanks сбалансированный солевой раствор, содержащий2% фетальной бычьей сыворотки (HF). Для каждого состояния, передача 100 мкл клеточной суспензии на лунку в 2 лунки 96-луночного планшета (одна скважина будет окрашивали антителом cTnT, а другой будет контроль вторичным антителом). Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин. Удалить супернатант с многоканальным микропипетки. Закрепить клетки: Добавьте 200 мкл раствора фиксирующих (набор компонентов) на лунку и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин. С помощью многоканального микропипетки осторожно вывести супернатант из лунок. Утилизацию супернатант в контейнер параформальдегид отходов. Вымойте фиксированные клетки дважды: Добавьте 200 мкл HF в каждую лунку. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и повторите шаг стирки еще раз. Фиксированные клетки могут храниться в течение одной недели в HF при температуре 4 ° С. Клетки проницаемыми: Центрифуга планшет при 300XG в течение 2 мин. Добавьте 100 мкл раствора пермеабилизирующего (набор компонентов) в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 2 мин и аспирата супернатант. Подготовка мастер сочетание анти-cTnT в HF при оптимальной концентрации для данного номера партии (Оптимальное разведение должно быть определено путем титрования и обычно находится в диапазоне от 1: 500 до 1: 2000). Для каждого условия (2 скважины в состоянии), добавляют 100 мкл мастер смеси в одну лунку (окрашивали образец) и 100 мкл простого HF в другую скважину (вторичный контроль антител). Инкубацию клеток при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и добавить 200 мкл на лунку HF. Повторите этот шаг мыть еще один раз. Подготовьте основной смеси вторичного антитела. Передача объема HF, который соответствует 100 мкл для каждой скважины (контроль вторичного антитела иcTnT окрашенных), подлежащего лечению. Добавить 1 мкл козьего антитела против мышиного APC вторичного антитела на 200 мкл HF (1: 200 разбавление). Пятно образцов. Добавляют 100 мкл окрашивающего раствора в каждую лунку (как контроль над вторичным антителом и анти-cTnT-запачканные скважин). Инкубируйте клетки в темноте при 4 ° С в течение 30 мин (держать пластину, покрытую или в темноте после добавления флуоресцентного вторичного антитела, чтобы избежать фотообесцвечивания). Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и добавить 200 мкл на лунку HF. Повторите этот шаг мыть еще один раз. Передача пробы до 5 мл с круглым дном проточной цитометрии анализа труб и выполнения проточной цитометрии для сигнала в канале APC с использованием стандартных протоколов для инструмента 19.