İnsan pluripotent kök hücrelerin Süspansiyon tabanlı Kardiyak Farklılaşma için mikro Agrega boyutu Optimizasyon

Orta Bileşenleri 1. Hazırlık Yıkama Orta hazırlayın. DMEM / F12, 100 ml başına 1 100X Penisilin / Streptomisin (pen / strep) ml 100x L-glutamin, 1 ml ve serum yerine 5 ml ekleyin. üreticinin talimatlarına göre bir kimyasal olarak tanımlı bir bazal Kardiyak indüksiyon ortamı hazırlar. Bu protokolde kullanılacak ortam Aşağıdaki stok reaktifler hazırlayın. L-askorbik asit: konik bir tüp içinde, 4 ° C'de steril ultra saf damıtılmış su içinde, ml başına 5 mg bir stok çözelti hazırlayın. Buz üzerinde bu çözüm bırakın ve çözünen tamamen eriyene kadar periyodik tüp vorteks. -Filtre sterilize 0.22 mikron şırınga filtre kullanılarak Askorbik Asit çözümü. askorbik asit çözeltisi, 1 ml hacimde hazırlayın ve -20 ° C'de bu alikotları saklayın. her ortamı hazırlanır taze buzları çözülmüş bir alikotu kullanın. Orta hazırlama gününde, Bazal Kardiyak İndüksiyon Orta 1 ml monotiyogliserol (MTG) 13 ul sulandırmak. Kullanılmayan, seyreltilmiş MTG atın. -20 ° C'de saklamak için transferin (30 mg / ml) 1 ml'lik eş payları hazırlayın. Mağaza 3 aya kadar 4 ° C 'de alikotları çözülmüş. % 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden, 4 mM hidroklorik asit (HCI) hazırlayın. Bir duman başlığı içinde, ultra saf damıtılmış su, 50 ml 6.0 N HCI çözeltisi 30 ul ekle. -Filtre sterilize 0.22 mikron şırınga filtre kullanarak çözüm. 50 mi HCI çözeltisine% 25 BSA çözeltisi 2 ml ilave edilir. % 0.1 BSA ihtiva eden fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlayın. ml PBS başına 25% BSA çözeltisi 20 ul ekle. İnsan kemik morfogenetik protein 4 (BMP-4) stok çözeltisi (10 ng / | il) hazırlayın. % 0.1 BSA içeren, 4 mM HCl tampon çözeltisi, 1 ml BMP-4 liyofilize 10 ug çözülür. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın. İnsan Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (bFGF) stok çözeltisi hazırlayın(10 ng / | il). % 0.1 BSA içeren fosfat tamponlu salin içinde 1 ml (PBS) içinde 10 ug liyofilize bFGF eritin. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın. Insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) stok çözeltisi (5 ng / ml) hazırlayın. % 0.1 BSA içeren 1 ml PBS içinde 5 ug liyofilize VEGF çözülür. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın. Aktivin bir stok solüsyonu (10 ng / ul) hazırlayın. % 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden 1 ml PBS aktivin liyofilize bir 10 ug çözülür. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın. Wnt Üretimi-2 (IWP-2) stok çözeltisi (10 mM) inhibitörü hazırlayın. 429 ul dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2 mg IWP-2 içinde çözülür. -80 ° C de saklamak için 10 ul alikotları hazırlayın. Komple Kardiyak İndüksiyon Orta hazırlayın. Bazal Kardiyak Ortamına 100 ml için 1 100X Pen / Strep ml 100x L-glutamin, 1 ml, transferrin 500 ul, 1 ekleyinTaze çözülmüş bir askorbik asit ml ve MTG 300 ul. Kullanılmayan ortamı atın. Microwell Plate 2. Hazırlık Not: Tüm adımlar, biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. plaka kullanılacak her bir çukuruna 0.5 ml yıkama çözeltisi (kit bileşeni) ekleyin. Çözelti iletişim Her kuyucuktan içindeki tüm yüzeyi, 2 dakika boyunca 840 x g'de santrifüj plaka sağlamak. Oda sıcaklığında 30 ile 60 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. Kuyulardan Durulama Çözüm aspire. Aşağıdaki gibi her bir kuyunun iki kez yıkayın: Her bir oyuğa PBS 1 ml ekleyin, santrifüj plakasını 2 dakika süreyle 840 xg'de ve sonra PBS aspire. hPSC 3. oluşumu Microwell Plate agregatlar Not: Tüm adımlar, biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. 37 ° C su banyosu içinde yıkama ortamında yerleştirin. NOT: hacimli HP kuyu = 1 ml x gerekli sayıdaayrışmış olacak SC. tek hücrelere hPSCs ayrıştırmaları Not: Bu adımlarda 6 kuyu plakalar üzerinde kültür hücreleri ayrışma açıklar – reaktif hacimleri farklı kültür biçimleri için orantılı ölçeklendirilebilir. Her hPSC kültüründen de ayrılma için kültür ortamı aspire. ayrışma enzim 1 ml de her durulama ve hemen, her bir oyuktan ayrılma enzimi aspire. NOT: Artık ayrışma enzim hücreleri ayırmak için yeterli olmalıdır. 3 dakika için 37 ° C'de inkübe plakası. her iyi yıkama ortamında 1 ml ilave edilir ve mekanik olarak doku kültürü yüzeyi üzerinde P1000 mikropipetöre ile yıkayın Orta pipetleme doku kültürü yüzeyinden hücreleri ayırmak. ayrışma eksik ve hücre kümeleri kalır gibi görünüyor, bu noktada bir süzgece süspansiyon geçmektedir. 15 ml konik tüp ve saklamak için hücre süspansiyonu aktarıninkübatör boru hücre sayısı bir sonraki aşamada gerçekleştirilir ise. Bir hücre sayımı gerçekleştirin: Önceki adımda elde hücre süspansiyonu, 10 ul numune alın. Tripan Blue 30 ul ekleyin ve pipetleme tarafından iyice süspansiyon karıştırın. Bir hemasitometre her odasına Tripan Mavisi lekeli hücrelerin 10 ul aktarın ve 10X amacı ile ters mikroskop altında görselleştirmek. hücreleri saymak. Hücre sayımı sonuçlarından, mikro tepsinin bölmesi başına 1.2 x 10 6 hücre tohumlanır kaç kuyu hesaplar. Hesaplamak Toplama Orta kuyu başına 1 ml hücreleri tohum için gerekli. toplama ortamı hazırlayın. Tam Kardiyak Ortamına 10 ml başına BMP4 stok çözeltisi 0.5 ul (nihai konsantrasyon = 0.5 ng / ml) ve Y-27632 ROCK inhibitörü (son konsantrasyon = 10 uM) ilave edilir. inkübatör ve Santrifüj gelen hPSCs içeren konik tüp kaldırmakge 5 dakika 200 x g'de tüpü. Yıkama ortamı aspire ve ml başına 1.2 x 10 6 hücre yoğunluğunda agregasyon ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Mikro plakanın her bir PBS yıkama solüsyonu aspire. homojen bir şekilde dağılması ve de mikro plaka üzerindeki her bir hücre süspansiyonu tohumu 1 mi, P1000 micropipettor kullanılması. kuyu sayıda tohum, periyodik olarak çökelmeyi önlemek hücre süspansiyonu girdap. 5 dakika boyunca 200 x g'de plaka santrifüjleyin. Hücreler her kuyucuklarda altına bükülmüş olan onaylamak için mikroskop altında plaka uyun. % 5 CO2,% 5 O2 (hipoksik) kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe levhasını. 4. Kardiyak İndüksiyon Aşama 1 birikmesini takiben bir gün (gün 1), (kuyu, hacim = 1 mi x sayıda 24 plaka için) Aşama 1 İndüksiyon ortamı gerekli hacmi hazırlar. tam 1 mlKalp endüksiyon ortamı, BMP4 stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 10 ng / ml) 1 ul, bFGF stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 5 ng / ml), 0.5 ul ve Aktivin A 0.6 ul (nihai konsantrasyon = 6 ng / mi). En az 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde orta yerleştirin. inkübatör Mikro plakasını sökün. mikroskop altında agrega kontrol edin. hemen sonrası santrifüj toplama ile karşılaştırıldığında, onlar düzgün kenarlara (daha yuvarlak ve önceki günden daha az bir kare) ile sağlam görünmelidir. mikro içindeki agrega bozmadan süpernatantı: Yatay seviyesini Mikro plaka tutun (yani., Eğim vermeyin). her bir mikro plaka için, kültür ortamı yüzeyinde ve de kenarına P1000 mikropipetöre ucu yerleştirin. Yavaş yavaş mikro altındaki agrega rahatsız etmemek için dikkatli olmak, orta kaldırmak. t azaltılmasından sonraDokulu mikro yüzeyinden yaklaşık 1 ila 2 mm de orta düzeyde yavaşça hacmi yeterince düşük bir kez sıvı hareketi büyük ölçüde azalır oyuk (bir tarafında orta toplamak için plaka eğme kaldırılmasına ve elde agrega önlemek için daha kolay ) bireysel mikro dışarı. Yavaş yavaş kuyuda kalan orta dışarı pipetle. agrega bireysel mikro kalır sağlarken taze Aşama 1 İndüksiyon Orta eklemek için: P1000 micropipettor ile Aşama 1 indüksiyon ortamı 1 ml çizin. Kuyunun içindeki kenarına doğru pipet tutun ve çok yavaş bir şekilde oyuk iç duvarına karşı orta dağıtın. Kalan Kuyular için tekrarlayın. 3 gün boyunca hipoksik koşullar altında inkübatör plaka dönün. 5. Kardiyak İndüksiyon 2. Aşama 4. günde, bir yerde, 15 dakika en az 37 ° C su banyosunda (kuyu hacim = sayısı x 2 mi) ortam yıkayın. (Nihai konsantrasyon = 10 ng / ml), VEGF stok çözeltisi 2 ul, tam bir kardiyak Ortamına ml'si başına 0.5 ul IWP-2: Aşama 2 Ortamı (Wells x 1 ml hacim = sayısı) gerekli hacmi hazırlanması stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 5 um). 15 dakika en az 37 ° C su banyosu içinde hazırlanmış Aşama 2 İndüksiyon ortamı yerleştirin. 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, mikro levhanın her bölmesine agrega hasat ve konik tüp (15 mL tüp başına 10 kuyuları için toplama) 15 ml toplam süspansiyon toplamak. agregaların hipoksik kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca oturmasına izin verin. NOT: Bu adım bozulmamış agrega tek hücrelerin ve hücre artıklarının ayırmak için önemlidir. Kalıntı endüktif sitokinler çıkarmak için önceden ısıtılmış yıkama ortamı 10 ml agrega dikkatle süpernatan aspire ve tekrar süspansiyon (örn Aktivin bir hatta çok düşük bir co güçlü bir sinyal molekülü olanncentrations). 2 dakika için 50 x g'de santrifüjleyin agrega. süpernatant aspire. önceden ısıtılmış İndüksiyon 2 Ortamda pelet agrega tekrar süspansiyon. oyuk başına 1 ml, 24-çukurlu ultra düşük bağlanma (ULA) plakaya toplam süspansiyon aktarın. üniforma, sıkı hücre kümeleri olarak mikroskop altında agrega uyun. 6. günde kadar hipoksik koşullar altında inkübe edilir. 6. Kardiyak İndüksiyon 3. Aşama 6. günde, Sahne 3 İndüksiyon Orta (kuyuların x 1 ml hacim = sayısı) gerekli hacmi hazırlayın. Tam Kardiyak Ortamına 1 ml için 2 | il VEGF stok solüsyonu (nihai konsantrasyon = 10 ng / ml) ve bFGF stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 5 ng / ml), 0.5 ul ekle. 15 dakika en az 37 ° C su banyosu içinde hazırlanan Aşama 3 uyarma ortamına yerleştirin. toplam 10 ml'ye kadar havuzu, 15 ml konik tüp agrega aktarmak için 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanıntüp başına s. agrega yerleşmek için 10 dakika bekleyin. Süpernatantı aspire ve önceden ısıtılmış 3. Aşama İndüksiyon Ortamda agrega tekrar süspansiyon. 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, oyuk başına 1 ml, 24-çukurlu ULA plaka içine agrega dağıtmak. günde 10, Evre 3 İndüksiyon Orta Kademe 6.1 uyarınca (kuyuları x 1 ml hacim = sayısı) gerekli hacmi hazırlayın. tüp için agrega 10 ml'ye kadar havuzu, 15 ml konik tüp agrega transfer etmek için, 5 ml serolojik pipet kullanın. agrega yerleşmek için 10 dakika bekleyin. Süpernatantı aspire ve Sahne 3 İndüksiyon Orta içinde agrega tekrar süspansiyon. 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, oyuk başına 1 ml, 24-çukurlu ULA plaka içine agrega dağıtmak. iki gün hipoksik koşullar altında inkübe edilir. 12. günde kültür süresinin geri kalanı (37 ° C,% 20 O2,% 5 CO2) için normoksik oksijen seviyesi hücrelerin inkübe edilmesi başlar. NOT:Bu zaman noktasından sonra, hücreler artık hipoksik koşullar altında kültürlenir. Bu tam orta alışverişini tekrarlayın hücre hasat kadar gün 14 başlayan her 4 günde bir, (6.2 ve 6.3 adımları) (tipik olarak, zirve kardiyomiyosit konsantrasyonları farklılaşma 14 gün sonra gözlenir). Kardiyak Troponin T (cTnT) Microwell Kültür Çıktı İfade Frekans 7. Akım Sitometri Analizi şöyle agrega ayrıştırmaları: 15 ml konik tüp agrega 1 kuyusunu aktarmak için bir 5 ml serolojik pipet kullanın. 2 dakika süreyle 50 xg'de agrega Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire. agrega taze çözülmüş 1 mg / ml kollajenaz, Tip II çözeltisi 1 ml. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne toplam süspansiyon aktarın. gece boyunca, oda sıcaklığında kollajenaz tip II agrega inkübe edin. Ertesi gün, nazikçe agrega ayırmak için P1000 micropipettor kullanmakhomojen bir tek hücre süspansiyonuna aktarılmış. agregalar hali hazırda ayrışmadığı yoksa, agrega yerleşmek süpernatanı havalandırın, ve oda sıcaklığında 1 ila 2 dakika süre ile Ayrılma enzim 700 ul agrega inkübe edin. Yavaşça ayırmak P1000 micropipettor ile Agregalar 1 ila 2 kez pipetle. ayrılma enzimi seyreltilir: 1 mg / ml DNAz stok çözeltisi 14 ul ihtiva eden yıkama ortamı içinde 700 ul ekle. 2 dakika boyunca 300 xg'de bir tezgah üstü mıkro kullanarak kalan süspansiyon bir hücre sayımı gerçekleştirmek ve santrifüj 10 ul örnek almak. bir hücre sayımı yapın: tripan mavi eşit hacimde 10 ul sayımı örnek boyama ve bir hemositometre kullanılarak sayılır. mikrosantrifüj kalan hücreleri içeren 1,5 ml'lik ependorf tüp çıkarın. Süpernatant aspire ihtiva eden Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi içinde 100 ul başına 200,000 ila 500,000 hücre konsantrasyonunda, hücrelerin tekrar süspansiyon% 2 cenin sığır serumu (HF). Her durum için, hücre süspansiyonu 100 ul başına oyuğa 96 oyuklu bir plaka (bir de cTnT antikoru ile boyanmış olacak ve ikincil antikor kontrolü olacaktır) 2 kuyu aktarın. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka santrifüj. Bir çok kanallı micropipettor ile süpernatantı. hücreleri saptamak: oyuk başına sabitleme çözeltisi (kit bileşeni) 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca plaka inkübe edin. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka santrifüj. dikkatle kuyulardan süpernatant çekilme çok kanallı bir micropipettor kullanın. Bir paraformaldehid atık kabına süpernatant bertaraf edin. İki kez sabit hücreleri yıkayın: her kuyuya HF 200 ul ekleyin. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka santrifüj. Süpernatantı aspire ve bir kez daha yıkama adımı tekrarlayın. Sabitlenen hücreler, 4 ° C'de HF bir haftaya kadar saklanabilir. Hücreleri permeabilize: 300 Plakayı santrifüj2 dakika boyunca xg. Her bir oyuğa besleyici çözeltiyi (kit bileşeni) 100 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe plakası. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka Santrifüj ve süpernatant aspire. Verilen bir sayısı için uygun konsantrasyonda HF anti-cTnT bir ana karışımı hazırlanması (uygun seyreltme titrasyon ile belirlenen ve tipik olarak 1 arasında değişmektedir gerekir: 500 ila 1: 2,000). Her durum (koşul başına 2 kuyu), bir kuyunun (lekeli örnek) ve diğer kuyu (sekonder antikor kontrolü) düz HF 100 ul ana karışımı 100 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe hücreleri. 2 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj. Süpernatantı aspire ve oyuk başına HF 200 ul ekleyin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. ikincil antikor bir master karışımı hazırlayın. Bir her kuyu için 100 ul karşılık HF hacmini (sekonder antikor kontrolü aktarın vecTnT lekeli) ile muamele edilir. (: 200 dilüsyon 1) HF 200 ul başına keçi anti-fare-APC sekonder antikor 1 ul ekle. örnekleri Leke. Her bir oyuğa (sekonder antikor kontrolü ve anti-cTnT lekeli kuyu her ikisi de) boyama çözeltisi 100 ul ekle. 30 dakika süre ile 4 ° C'de (ışıkla ağartma bilmek fluorescent sekonder antikor ilave edildikten sonra kaplı plaka ya da karanlıkta tutun) karanlıkta inkübe hücreleri. 2 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj. Süpernatantı aspire ve oyuk başına HF 200 ul ekleyin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. Analiz tüpleri sitometresinde 5 ml yuvarlak dipli akışı örnekleri aktarın ve enstrüman 19 için standart protokolleri kullanarak APC kanalında sinyal flow sitometri gerçekleştirin.