인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

중간 구성 요소 1. 준비 워시 매체를 준비합니다. DMEM / F12 100 ㎖ 당 1 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)의 ㎖, 100X L- 글루타민 1 ㎖ 혈청 대체 5 mL를 추가한다. 제조업체의 지침에 따라 화학적으로 기저 심장 유도 매체를 준비합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 미디어 다음 재고 시약을 준비합니다. L- 아스코르브 산가 : 원뿔 튜브에 4 ° C, 멸균 울트라 순수한 증류수 ㎖의 당 5 밀리그램의 재고 솔루션을 준비합니다. 얼음에이 솔루션을두고 용질이 완전히 용해 될 때까지 주기적으로 튜브를 소용돌이. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 아스코르브 산 용액. 아스코르브 산 용액 1 ml의 분취 량을 준비하고 -20 ℃에서 분취 액이 저장한다. 때마다 매체를 준비 갓 해동 나누어지는을 사용합니다. 매체 제조 당일기저 심장 유도 보통 1 ㎖에 monothioglycerol (MTG) 13 μL 희석. 사용하지 않는, 희석 MTG 폐기하십시오. -20 ℃에서 저장 트랜스페린 (30 ㎎ / ㎖) 1 ml의 분취 량을 준비한다. 스토어는 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 분취 량을 해동. 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 4 mM의 염산 (HCL)을 준비한다. 흄 후드에서, 초순수, 증류수 50 ml의 6.0 N HCl 용액 30 μL를 추가한다. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 용액. 50 ml의 HCl 용액에 25 % BSA 용액 2 ㎖를 추가합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. ml의 PBS 당 25 % BSA 용액 20 μl를 추가합니다. 인간의 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP-4) 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 4 mM의 염산 완충액 1 ㎖에서 BMP-4 10 μg의 동결을 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. 인간 섬유 아세포 성장 인자 2 (bFGF를) 원액을 준비(10 NG / μL). 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 1 ㎖ (PBS) 10 μg의 동결 건조의 bFGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. 인간의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 원액 (5 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 PBS 1 ㎖에 5 μg의 동결 건조 된 VEGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. 티빈에게 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS 1 ㎖에 티빈 동결 10 μg의 용해. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. 이 Wnt 생산-2 (IWP-2) 원액 (10 밀리미터)의 억제제를 준비합니다. 429 ㎕의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 2 mg을 IWP-2를 녹여. -80 ° C에서 저장하는 10 μl의 분취 량을 준비합니다. 전체 심장 유도 매체를 준비합니다. 기저 심장 유도 보통 100 ㎖, 1 ~ 100X 펜 / ml의 스트렙토, 100X L- 글루타민 1 ㎖, 트랜스페린의 500 μL, 추가 1신선하게 해동 아스코르브 산 용액 및 MTG 300 μL. 사용되지 않는 매체를 폐기하십시오. 마이크로 웰 플레이트 2. 준비 참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. 접시에 사용되는 각 웰에 0.5 ml의 세척 용액 (키트의 구성 요소)를 추가합니다. 용액 연락처 각 마이크로 웰의 내부 표면 전체를 2 분 동안 840 XG에 플레이트를 원심 분리되도록한다. 실온에서 30 ~ 60 분 동안 접시를 품어. 우물에서 세척 용액을 대기음. 다음과 같이 각 웰에 두 번 씻으 : 각 웰에 PBS 1 ml의 추가, 원심 분리기 판을 2 분 동안 840 XG에 다음 PBS를 대기음. hPSC 3. 형성은 마이크로 웰 플레이트에서 집계합니다 참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 세척 매체를 놓습니다. 참고 : 볼륨은 HP의 우물 = 1 ML의 X 번호를 요구해리 될 것이다 SC. 하나의 세포에 hPSCs을 떼어 놓다 참고 :이 단계는 6 웰 플레이트에서 배양 세포의 분리를 설명 – 시약의 볼륨은 서로 다른 문화 형식에 대해 비례 적으로 확장 할 수 있습니다. 각 hPSC 문화에서 잘 해리의 문화 매체를 기음. 분해 효소 1 ㎖로 각 웰을 헹군 후 즉시 각 웰의 분해 효소 대기음. 주 : 잔류 분해 효소는 세포를 해리하기에 충분해야한다. 3 분 37 ° C에서 접시를 품어. 각 웰에 세척 보통 1 ㎖를 첨가하고 기계적 조직 배양 표면 위에 P1000의 micropipettor로 세척 중간 피펫 팅하여 조직 배양 표면에서 세포를 해리. 해리가 완료되지 않은 세포 덩어리가 남아있는 것으로 나타나는 경우,이 시점에서 스트레이너를 통해 정지를 전달합니다. 15 ML 원뿔 관 및 저장에 세포 현탁액을 전송인큐베이터에서 튜브는 셀 수는 다음 단계에서 수행된다. 셀 카운트를 수행합니다 이전 단계에서 수집 된 세포 현탁액 10 μL 샘플을보십시오. 트리 판 블루의 30 μl를 추가하고 피펫으로 잘 현탁액을 섞는다. 혈구의 각 실에 트리 판 블루 염색 된 세포의 10 μl를 전송하고 10 배 목적으로 반전 현미경으로 시각화. 세포를 계산합니다. 셀 카운트 결과로부터, 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 1.2 × 106 세포로 시딩 수 잇는 웰 구한다. 계산 집계 매체는 물론 당 1 ml의에서 세포를 배정해야합니다. 집계 매체를 준비합니다. 전체 심장 유도 보통 10 ㎖, 당 BMP4 원액 0.5 μL (최종 농도 = 0.5 NG / ㎖) 및 Y-27632 ROCK 억제제 (최종 농도 = 10 μM)를 추가합니다. 인큐베이터와 centrifu에서 hPSCs를 포함하는 원뿔 튜브를 제거GE의 5 분 200 XG에 튜브. 세척 매질 대기음 용액 당 1.2 × 106 세포의 밀도로 응집 매질에서 세포를 재현 탁. 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 PBS 세척 용액을 대기음. 균등하게 분배하고 잘 마이크로 웰 플레이트에 각 세포 현탁액의 씨앗 1 ml를하는 P1000의 micropipettor를 사용하여. 웰 다수 시드 주기적 침강 방지 세포 현탁액을 소용돌이. 5 분 동안 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 세포는 각각의 마이크로 웰의 바닥에 방사 한 확인하기 위해 현미경으로 접시를 관찰한다. 5 % CO 2, 5 % O 2 (저산소증) 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 4. 심장 유도 1 단계 집계 다음의 어느 날 (1 일), (우물, 볼륨 = 1 ML의 X 번호 24 웰 플레이트 용) 1 단계 유도 매체의 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 1 ㎖를 들어심장 유도 매체, BMP4 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖) 1 μL, bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μL와 티빈 (A)의 0.6 μl를 추가 (최종 농도 = 6 NG / ㎖). 적어도 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 매체를 넣습니다. 인큐베이터에서 마이크로 웰 플레이트를 제거합니다. 현미경 집계를 검사합니다. 즉시 후 원심 분리기 집계에 비해, 그들은 부드러운 가장자리 (더 라운드 전날보다 작은 광장)에 그대로 나타납니다. 마이크로 웰 내부의 집계를 방해하지 않고 뜨는을 제거 : 수평 레벨을 마이크로 웰 플레이트를 잡고 (예.,을 기울이지 않는다). 각 웰 마이크로 웰 플레이트에 대해, 배지의 표면에 상기 웰의 가장자리에 대해 P1000의 micropipettor의 선단을 배치. 천천히 마이크로 웰의 하단에있는 집계를 방해하지 않도록주의, 배지를 제거합니다. t을 감소 후텍스쳐 마이크로 웰의 표면으로부터 약 1 내지 2 mm로 그 중간 레벨 서서히 볼륨이 충분히 낮아지면 유체 운동이 크게 감소 웰 (일측에 매체를 수집 플레이트를 기울여 드러내 점점 응집을 방지하기 쉽다는 ) 개별 마이크로 웰의 아웃. 천천히 잘 남아있는 매체를 피펫. 집계는 개별 마이크로 웰에 남아 확보하면서 신선한 1 단계 유도 매체를 추가하려면 다음과 P1000의 micropipettor와 함께 1 단계 유도 배지 1 ㎖을 그립니다. 우물의 안쪽 가장자리에 피펫 팁을 잡고 아주 천천히 잘의 내부 벽에 매체를 분배. 나머지 우물에 대해 반복합니다. 3 일 저산소 조건에서 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 5. 심장 유도 2 단계 하루에 4 일, 장소는 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 (우물의 부피 = 수 × 2 ㎖) 매체를 씻는다. (최종 농도 = 10 NG / ㎖) VEGF 원액의 2 μl를 추가, 전체 심장 유도 중간 ml의 당 0.5 ㎕를 IWP-2 : 2 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수)의 필요한 양을 준비 주식 솔루션 (최종 농도 = 5 μM). 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비된 2 단계 유도 매체를 넣습니다. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 집계를 수확하고 원뿔 튜브 (15 ML 튜브 당 10 우물까지 수집) 15 용액에 집계 정지를 수집합니다. 집계가 저산소 배양기에서 15 분 동안 정착하도록 허용합니다. 참고 :이 단계는 그대로 집계에서 단일 세포와 세포 파편을 분리하는 것이 중요합니다. 잔류 유도 사이토 카인을 제거하기 위해 미리 예열 워시 보통 10 ㎖의 집계를 조심스럽게 뜨는을 기음과 재현 탁 (예를 들면, 티빈 A는 심지어 매우 낮은 공에 강력한 신호 분자이다ncentrations). 2 분 50 XG에서 집계를 원심 분리기. 뜨는을 대기음. 예비 가온이 유도 매체에 펠렛을 재현 탁 집합체. 물론 당 1 ml의에서 24도 초저 첨부 파일 (ULA) 판에 집계 정지를 전송합니다. 유니폼, 꽉 세포 클러스터와 현미경으로 집계을 준수하십시오. 6 일까지 저산소 조건에서 품어. 6. 심장 유도 3 단계 하루 6 일, 3 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 심장 유도 중간 1ml를 들어, 2 μL VEGF 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖), 및 bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μl를 추가한다. 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비 3 단계 유도 매체를 넣습니다. 총 10 ㎖까지 풀링, 15 ml의 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여튜브 당들. 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 미리 예열 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포. 10 일에, 3 단계 유도 중간 단계 6.1에 따라 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다. 튜브 당 집계 10 ㎖까지 풀링, 15 ML 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ml의에게 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포. 이틀 동안 저산소증 조건 하에서 인큐베이션. 일 12 일 배양 기간의 나머지 (37 ° C, 20 % O 2, 5 % CO 2)에 대한 정상 산소의 산소 농도에서 세포를 배양하기. 노트:이 시점 후에, 세포가 더 이상 저산소증 조건 하에서 배양 없다. 이 완전 배지 교환을 반복 세포 수확까지 14 일부터 4 일마다 (6.2 및 6.3 단계) (일반적으로, 피크 심근 농도는 차별화의 14 일 후 관찰된다). 심장 트로포 닌 T (cTnT를) 마이크로 웰 문화 출력의 발현 빈도 7. 유동 세포 계측법 분석 다음과 같이 집계를 떼어 놓다 : 15 ML 원뿔 튜브에 집계 1도를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 2 분 50 XG에서 집계을 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 집계에 갓 용해 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 유형 II 솔루션 1 ML을 추가합니다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 집계 정지를 전송합니다. 실온에서 하룻밤 동안 콜라게나 제 II 형의 응집체 부화. 다음 날, 부드럽게 집계를 떼어 놓다하기 위해 P1000의 micropipettor를 사용균질 한 단일 세포 현탁액. 집계가 쉽게 해리하지 않는 경우, 집계를 정착 뜨는을 대기음하고, 실온에서 1 ~ 2 분 동안 해리 효소의 700 μL의 집계를 품어. 조심스럽게 해리 할 수있는 P1000의 micropipettor으로 집계 1 ~ 2 번 피펫. 해리 효소를 희석 : 1 ㎎ / ㎖ DNase의 원액 14 μl를 포함하는 세척 매체의 700 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 벤치 탑의 microcentrifuge를 사용하여 나머지 정지를 셀 수를 수행하고, 원심 분리하기 위해 10 μL 샘플을 가져 가라. 세포 계수를 수행하여 트리 판 블루 동량 10 μL 계산 샘플 얼룩과 혈구를 사용하여 계산. 의 microcentrifuge에서 남아있는 세포를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 제거합니다. 뜨는을 기음과 포함 행크스 균형 소금 용액에 100 μL 당 200,000 500,000 세포의 농도로, 세포를 재현 탁2 % 태아 소 혈청 (HF). 각 조건을 위해, 세포 현탁액 100 ㎕ 당 웰을 96- 웰 플레이트 (하나의 웰은 cTnT의 항체로 염색되며, 다른 하나는 이차 항체 제어 것) 2 웰 옮긴다. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 멀티 채널 micropipettor와 뜨는을 제거합니다. 세포를 수정 : 잘 당 고정 솔루션 (키트의 구성 요소)의 200 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 접시를 품어. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 우물에서 뜨는을 철회 멀티 채널 micropipettor를 사용합니다. 파라 포름 알데히드 폐기물 용기에 뜨는을 폐기하십시오. 두 번 고정 된 세포를 씻으 : 각 웰에 HF 200 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 뜨는을 대기음, 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 고정 된 세포는 4 ° C에서 HF 최대 일주일 동안 저장 될 수있다. 세포 Permeabilize 하시려면 : (300)에서 접시를 원심 분리기2 분 XG. 각 웰에 Permeabilization 용액 (키트 성분) 100 ㎕를 추가하고 실온에서 5 분 동안 평판을 배양한다. 2 분 300 XG에 접시를 원심 분리기와 뜨는을 대기음. 주어진 로트 번호에 대한 최적의 농도로 HF에 방지 cTnT의의 마스터 믹스를 준비합니다 (최적의 희석은 적정에 의해 결정되며 일반적으로 1 범위해야합니다 : 500 1 : 2,000). 각 조건 (조건 당 2 웰)의 경우, 하나의 잘 (스테인드 샘플)과 다른 잘 (이차 항체 제어)에 일반 HF 100 ㎕에 마스터 믹스 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 이차 항체의 마스터 믹스를 준비합니다. 마다 잘 100 μL에 해당하는 HF의 볼륨 (이차 항체 제어를 전송하고cTnT를 염색)의 치료를 받고. (: 200 희석 1) HF 200 μL 당 염소 항 – 마우스 – APC 차 항체의 1 μl를 추가합니다. 샘플을 얼룩. 각 웰 (이차 항체 제어 및 안티 cTnT를 묻은 우물 둘 다) 염색 용액 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C (photobleaching에 방지하기 위해 형광 차 항체를 추가 한 후 커버 플레이트 또는 어둠 속에서 유지)에 어둠 속에서 세포를 품어. 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 분석 튜브 사이토 5 ㎖ 둥근 바닥 흐름 샘플을 전송 한 기기 (19)의 표준 프로토콜을 사용하여 APC 채널에서 신호에 대한 유세포 분석기를 수행한다.