ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

培地成分の調製ウォッシュミディアムを準備します。 DMEM / F12の100ミリリットル当たり、100×ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）の1ミリリットルを追加し、100×L-グルタミンの1ミリリットル、および血清代替の5ミリリットル。 製造元の指示に従って、化学的に定義された基礎心臓誘導培地を準備します。 このプロトコルで使用されるメディアについては、以下のストック試薬を準備します。 L-アスコルビン酸：円錐管で、4°Cで滅菌超純蒸留水を1ml当たり5ミリグラムのストック溶液を準備します。 氷の上でこのソリューションをままにして、溶質が完全に溶解するまで、定期的にチューブをボルテックス。フィルター滅菌し、0.22μmのシリンジフィルターを使用して、アスコルビン酸溶液を。 アスコルビン酸溶液の1ミリリットルのアリコートを調製し、-20℃で、これらのアリコートを保存します。毎回媒体が用意されている解凍したてのアリコートを使用してください。 メディアの準備の日に、基礎心臓誘導培地の1ミリリットル中のモノチオグリセロール（MTG）の13μLを希釈します。未使用、希釈されたMTGを捨てます。 -20℃で保存するためにトランスフェリン（30 mg / mlで）の1ミリリットルのアリコートを準備します。ストアには、最大3ヶ月間4℃でアリコートを解凍します。 0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する4mMの塩酸（HCl）を準備します。ヒュームフードでは、超純蒸留水50ミリリットルに6.0 N HCl溶液の30μlを添加します。フィルター滅菌0.22μmのシリンジフィルターを用いて溶液。 50 mlのHCl溶液に25％BSA溶液2mlを加えます。 0.1％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 mlのPBSあたり25％のBSA溶液20μlを追加します。 ヒト骨形成タンパク質4（BMP-4）ストック溶液（10 ngの/μl）を準備します。 0.1％BSAを含有する4mMの塩酸緩衝液1mlにBMP-4、凍結乾燥の10μgを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。 ヒト線維芽細胞増殖因子2（bFGFの）原液を準備（10 ngの/μL）。 0.1％BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中のbFGF凍結乾燥に10μgを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。 ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）原液（5 ngの/μl）を準備します。 0.1％BSAを含むPBS 1ml中5μgの凍結乾燥されたVEGFを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。 アクチビンを原液（10 ngの/μl）を準備します。 0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS 1 mlにアクチビンAを凍結乾燥に10μgを溶解します。 -20℃で保存するために50μlのアリコートを準備します。 Wntシグナル生産-2の阻害剤（IWP-2）原液（10 mm）を準備します。 429μlのジメチルスルホキシド（DMSO）中に2mgのIWP-2を溶解させます。 -80℃で保存するために10μlのアリコートを準備します。 完全な心臓誘導培地を準備します。基礎心臓誘導培地の100ミリリットルに、100×ペニシリン/ストレプトマイシンの1ミリリットル、100×L-グルタミンの1ミリリットル、トランスフェリン、1の500μlを添加します解凍したてのアスコルビン酸、およびMTGを300μlのミリリットル。未使用のメディアを破棄します。 マイクロウェルプレートの調製注：すべてのステップは、生物学的安全キャビネット内で行うべきです。 プレートに使用される各ウェルに0.5ミリリットルリンス液（キットの構成要素）を追加します。各マイクロウェル内の溶液が接触することを全面を確実にするために、2分間、840×gでプレートを遠心します。 RTで30〜60分間、プレートをインキュベートします。 井戸からリンス液を吸引除去します。次のように各ウェルを2回洗浄：各ウェルに1mlのPBSを加え、遠心プレートを2分間、840×gで、その後、PBSを吸引除去します。 HPSCの3形成は、マイクロウェルプレートに集約します注：すべてのステップは、生物学的安全キャビネット内で行うべきです。 37℃の水浴中でウォッシュミディアムを置きます。 注記：HPのウェルの容積必要= 1ミリリットルのx個解離されますSC。 単一細胞にhPSCsを解離注：これらの手順は、6ウェルプレート上で培養した細胞の解離を記述する – 試薬容量が異なる培養フォーマットに比例スケーリングすることができます。 解離のために各HPSCの培養ウェルから培地を吸引除去します。解離酵素の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、その直後に、各ウェルからの解離酵素を吸引。 注：残留解離酵素は、細胞を解離するのに十分であるべきです。 3分間37℃でプレートをインキュベートします。 各ウェルに洗浄媒体の1ミリリットルを追加し、機械的に組織培養表面上P1000マイクロピペッターで洗浄中にピペッティングすることにより、組織培養表面から細胞を解離します。解離が不完全と、細胞塊が残っているように見える場合、この時点でのストレーナを介してサスペンションを渡します。 15mLのコニカルチューブとストアに細胞懸濁液を転送しますインキュベーター内のチューブの細胞数は、次の手順で行われます。 細胞数を実行します。 前のステップで収集した細胞懸濁液の10μlのサンプルを取ります。トリパンブルーの30μl加え、ピペッティングによりよくサスペンションを混ぜます。 血球計数器の各チャンバーにトリパンブルー染色細胞の10μLを移し、10倍の対物レンズとの倒立顕微鏡下で可視化します。細胞を数えます。 細胞計数結果から、マイクロウェルプレートのウェルあたり1.2×10 6個の細胞を播種することができるどのように多くのウェルを計算します。ウェルあたり1ミリリットルで細胞を播種するために必要な集計中を計算します。 凝集媒体を準備します。完全な心臓誘導培地の10ミリリットル当たり、BMP4ストック溶液（最終濃度= 0.5 ngの/ mlの）とY-27632 ROCK阻害剤（最終濃度=10μM）の0.5μlを添加します。 インキュベーターとcentrifuからhPSCsを含むコニカルチューブを削除しますGE 5分間、200×gでチューブ。洗浄培地を吸引し、1mlあたり1.2×10 6細胞の密度で集約培地中で細胞を再懸濁。 マイクロウェルプレートの各ウェルからPBS洗浄溶液を吸引します。 P1000のピペットを使用して、均等にマイクロウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを分配し、種子。ウェルの多数の種子に、定期的に沈降を防止するために、細胞懸濁液をボルテックス。 5分間、200×gでプレートを遠心。細胞は、各マイクロウェルの底に紡糸したことを確認するために顕微鏡下でプレートを観察します。 5％CO 2、5％O 2（ 低酸素 ）インキュベーター中、37℃で24時間プレートをインキュベート。 4.心臓誘導ステージ1 集計以下の1日（1日目）、（井戸の、体積= 1ミリリットルのx個の24ウェルプレート用）ステージ1誘導媒体の必要なボリュームを準備。完全1mlのための心臓の誘導培地は、BMP4ストック溶液（最終濃度= 10 ngの/ ml）を1μlの、bFGFのストック溶液（最終濃度= 5 ngの/ ml）を0.5μlの、およびアクチビンAの0.6μlを添加（最終濃度= 6 NG /ミリリットル）。少なくとも15分間、37℃の水浴中に媒体を配置します。 インキュベーターからマイクロウェルプレートを取り外します。顕微鏡下で凝集体を点検します。直後遠心分離機の集約と比較すると、彼らは滑らかなエッジ（複数のラウンドと前日よりも小さい四角）でそのまま表示されます。 マイクロウェル内部の凝集体を乱すことなく、上清を除去します。 水平レベルをマイクロウェルプレートを保持する（ すなわち 、それを傾けないでください）。マイクロウェルプレート上の各ウェルについて、培養液の表面およびウェルのエッジに対してP1000のピペットの先端を配置します。 ゆっくりとマイクロウェルの底部に凝集体を邪魔しないように注意しながら、培地を除去します。トンを削減した後、テクスチャマイクロウェル表面から1〜2mm程度に彼中レベル、徐々に音量が十分に低くなると、流体の動きが大幅に低減されたウェル（の片側に培地を収集するためにプレートを傾け、それを持ち上げ取得凝集を回避することが容易です個々のマイクロウェルのうち）。ゆっくりとウェル内に残っている培地をピペット。 凝集体が個々のマイクロウェルに残って確保しながら、新鮮なステージ1誘導培地を追加するには：P1000マイクロピペッターでステージ1誘導培地の1ミリリットルを描画します。ウェルの内側のエッジに対してピペットチップを持ち、非常にゆっくりとウェルの内壁に対して培地を分注します。残りのウェルについて、この手順を繰り返します。 3日間低酸素条件下でインキュベーターにプレートを返します。 5.心臓誘導ステージ2 4日目に、場所は15分の最低37℃の水浴中（ウェルの体積=数×2 ml）を培地を洗浄します。 （最終濃度= 10ng / mLの）VEGFストック溶液2μLを追加し、完全な心臓誘導培地1mlあたり0.5μlのIWP-2：ステージ2誘導培地（ウエル×1 mlの容量=数）の必要なボリュームを準備ストック溶液（最終濃度=5μM）。 15分の最低37℃の水浴中で準備されたステージ2誘導培地を置きます。 5ミリリットル血清学的ピペットを用いて、マイクロウェルプレートの各ウェルから凝集物を収穫し、（15ミリリットルチューブあたり10ウェルに、最大収集）15ミリリットルコニカルチューブ内に集約サスペンションを収集します。 凝集体が低酸素インキュベーターで15分間沈降することを可能にします。 注：この手順は、無傷の集合体から単一細胞と細胞破片を分離することが重要です。 残留誘導性サイトカインを除去するために、予め温めておいた洗浄培地10ml中で凝集体を注意深く上清を吸引除去し、再懸濁（ 例えば 、アクチビンAは、非常に低い共同で強力なシグナル伝達分子でありますncentrations）。 2分間50×gで凝集体を遠心分離します。上清を吸引除去します。予め温めておいた誘導2培地でペレット化凝集体を再懸濁します。 ウェルあたり1ミリリットルで24ウェル超低接着（ULA）プレートに集約サスペンションを転送します。均一な、タイトな細胞クラスターとして顕微鏡下で凝集体を守ってください。 6日目まで低酸素条件下でインキュベートします。 6.心臓誘導ステージ3 6日目に、ステージ3誘導培地（ウエル×1 mlの容量=数）の必要なボリュームを準備。完全な心臓誘導培地の1ミリリットルのために、2μlのVEGFストック溶液（最終濃度= 10ng / mLの）、およびbFGFのストック溶液（最終濃度= 5 ngの/ ml）を0.5μlを添加します。 15分の最低37℃の水浴中で準備ステージ3誘導培地を置きます。 凝集体を10mlまでプール15 mlのコニカルチューブに凝集体を移すために、5 mlの血清学的ピペットを使用してチューブあたりの。 凝集体がセトリングするための10分を許可します。上清を吸引除去し、予め温めておいたステージ3誘導培地中で凝集体を再懸濁します。 5ミリリットル血清学的ピペットを用いて、ウェル当たり1ミリリットルで24ウェルULAプレートに凝集体を再配布します。 10日目に、ステージ3誘導培地ステップ6.1あたりとして（ウエル×1 mlの容量=数）の必要なボリュームを準備。 チューブあたり凝集体の10ミリリットルまでプーリング、15ミリリットルコニカルチューブに凝集体を転送するために5ミリリットルに血清学的ピペットを使用してください。 凝集体がセトリングするための10分を許可します。上清を吸引し、ステージ3誘導培地中で凝集体を再懸濁します。 5ミリリットル血清学的ピペットを用いて、ウェル当たり1ミリリットルで24ウェルULAプレートに凝集体を再配布します。 2日間低酸素条件下でインキュベートします。 12日目に、培養期間（37°C、20％O 2、5％CO 2）の残りの酸素正常酸素レベルで細胞をインキュベートし始めます。 注意：この時点の後、細胞はもはや低酸素条件下で培養されていません。 この完全な培地交換を繰り返し、細胞収穫まで14日目から開始し、4日毎に、（6.2と6.3をステップ）（典型的には、ピーク心筋細胞濃度は、分化の14日目後に観察されています）。 心筋トロポニンT（cTnTの）マイクロウェル文化出力の発現頻度の7フローサイトメトリー分析次のように凝集体を解離します： 15ミリリットルコニカルチューブに凝集体の1をよく転送するために5ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。 2分間50×gで凝集体を遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。 骨材に新鮮に溶解し1mg / mlのコラゲナーゼタイプII溶液1mlを追加します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに集約サスペンションを転送します。室温で一晩コラゲナーゼタイプIIに凝集体をインキュベートします。 次の日、静かに凝集体を解離させるためにP1000のピペットを使用均質な単一細胞懸濁液に。凝集体が容易に解離しない場合は、凝集体を決済する上清を吸引し、室温で1〜2分間解離酵素700μlの中で凝集体をインキュベートします。ゆっくり解離するP1000マイクロピペッターで集合体を1〜2回ピペット。 解離酵素を希釈：1mg / mlのDNA分解酵素原液の14μLを含む洗浄媒体の700μLを加えます。細胞数を実行するために10μlのサンプルを取り、そして2分間300×gでベンチトップマイクロ遠心を使用して残りのサスペンションを遠心分離します。 細胞数を実行します：トリパンブルー等量の10μlのカウントサンプルを染色し、血球計数器を用いてカウントします。 微量から残りの細胞を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブを外します。上清を吸引除去し、含むハンクス平衡塩溶液に、100μlの20万〜500,000細胞の濃度で、細胞を再懸濁2％ウシ胎児血清（HF）。 各条件について、96ウェルプレートのウェルに2つのウェル（1ウェルはcTnTの抗体で染色され、他方は二次抗体対照である）当たり100μlの細胞懸濁液を移します。 2分間、300×gでプレートを遠心。マルチチャンネルピペットで上清を取り除きます。 細胞を固定：ウェル当たり固定ソリューション（キットの構成要素）の200μlを添加して、室温で15分間静置します。 2分間、300×gでプレートを遠心。注意深くウェルから上清を撤回するマルチチャンネルピペットを使用してください。パラホルムアルデヒドの廃棄物容器内の上清を廃棄してください。 二回固定した細胞を洗浄：各ウェルにHFの200μLを加えます。 2分間、300×gでプレートを遠心。上清を吸引し、もう一度洗浄ステップを繰り返します。固定した細胞を4℃でHFで最大1週間保存することができます。 細胞を透過性： 300でプレートを遠心2分間XG。 各ウェルに透過処理溶液（キットの構成要素）の100μlを添加して、室温で5分間静置します。 2分間、300×gでプレートを遠心し、上清を吸引除去します。 指定されたロット番号のための最適な濃度でHF中の抗cTnTののマスターミックスを調製する（最適希釈は、滴定によって決定され、一般的に1の範囲する必要があります：500〜1：2000）。 各条件（条件当たり2つのウェル）については、他のウェル（二次抗体コントロール）に1ウェル（染色標本）とプレーンHFの100μlにマスターミックスの100μlを添加します。 4℃で30分間細胞をインキュベートします。 2分間、300×gで細胞を遠心。上清を吸引し、ウェルあたりHFの200μlを添加します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。 二次抗体のマスターミックスを調製します。すべてのウェルについて100μlに相当するHFの量（二次抗体制御を移し、cTnTの染色）が治療されています。 （：200希釈1）HF200μlのあたりのヤギ抗マウスAPC二次抗体の1μLを加えます。 サンプルを染色します。 （二次抗体コントロールと抗cTnTの染色井戸の両方）を各ウェルに染色溶液100μlを加えます。 （光退色を避けるために、蛍光二次抗体を添加した後、プレートカバーさや暗所にしておく）、4℃で30分間、暗所で細胞をインキュベートします。 2分間、300×gで細胞を遠心。上清を吸引し、ウェルあたりHFの200μlを添加します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。 分析管サイトメーター5ミリリットル丸底流れにサンプルを移し、機器19のための標準プロトコルを使用して、APCチャネルの信号のためのフローサイトメトリーを行います。