אופטימיזציה גודל המצרפי Microwells עבור מבוססי השעיה בידול לב של תאי גזע אנושיים pluripotent

1. הכנת רכיבים בינוני כן לשטוף בינוני. לכל 100 מ"ל של DMEM / F12, להוסיף 1 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), 1 מ"ל של 100x L- גלוטמין, ו -5 מ"ל של החלפת בסרום. הכן את מדיום אינדוקצית לב בסל הגדרה הכימית פי הוראות היצרן. כן ריאגנטים המניות הבאים למדיה אשר ישמשו בפרוטוקול זה. L-Ascorbic Acid: כן פתרון מניות של 5 מ"ג לכל מיליליטר ב 4 מעלות צלזיוס, מים מזוקקים טהורים סטרילי בתוך שפופרת חרוטים. השאירו את הפתרון הזה על הקרח מערבולת הצינור מעת לעת עד המומס הוא נמס לגמרי. סנן לעקר את הפתרון חומצה אסקורבית באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. הכן 1 aliquots מ"ל של תמיסת חומצה אסקורבית ולאחסן aliquots אלה ב -20 ° C. השתמש aliquot טרי מופשר כל מדיום זמן מוכן. ביום הכנה בינונית, לדלל 13 μl של monothioglycerol (MTG) ב 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה בסל לב. בטל MTG בשימוש, בדילול מלא. הכן 1 aliquots מ"ל של transferrin (30 מ"ג / מ"ל) כדי לאחסן ב -20 ° C. חנות מופשרת aliquots ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. הכן 4 חומצה הידרוכלורית מ"מ (HCl) המכיל 0.1% שור סרום אלבומין (BSA). במנדף קטר, להוסיף 30 μl של 6.0 פתרון N HCl 50 מ"ל מים מזוקקים טהורים לחלוטין. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מזרק מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף 2 מ"ל של תמיסת BSA 25% לפתרון HCl 50 מ"ל. כן בופר פוספט (PBS) המכיל 0.1% BSA. הוסף 20 μl של פתרון BSA 25% לכל מ"ל PBS. כן האדם העצם המוךפו"גנטי שהולך חלבון 4 (BMP-4) פתרון מניות (10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized BMP-4 ב 1 מ"ל של 4 פתרון חיץ מ"מ HCl המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C. כן 2 פקטור גדילת פיברובלסטים אדם (bFGF) פתרון מניות(10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized bFGF ב 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C. הכן פקטור הגדילה של אנדותל כלי דם האדם (VEGF) פתרון המניות (5 ng / μl). ממיסים 5 מיקרוגרם VEGF lyophilized ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% BSA. כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C. כן Activin פתרון מניות (10 ng / μl). ממיסים 10 מיקרוגרם lyophilized Activin א '1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% שור סרום אלבומין (BSA). כן 50 μl aliquots לאחסן ב -20 ° C. כן מונע של Wnt הפקה-2 (IWP-2) פתרון מניות (10 מ"מימ). ממיסים 2 מ"ג IWP-2 ב 429 μl דימתיל sulfoxide (DMSO). כן 10 μl aliquots לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. כן בינוני אינדוקצית לב שלם. ל -100 מ"ל של Basal לב אינדוקציה בינונית, מוסיפים 1 מ"ל של 100x פן / סטרפטוקוקוס, 1 מ"ל של 100x L- גלוטמין, 500 μl של transferrin, 1מ"ל של חומצה אסקורבית מופשר טרי, ו -300 μl של MTG. בטל בינוני בשימוש. 2. הכנת צלחת microwell הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. הוסף 0.5 מ"ל פתרון שטיפה (רכיב בערכה) היטב כל אשר ישמשו על הצלחת. כדי להבטיח כי המגעים פתרון פני השטח כולו בתוך כל microwell, בצנטריפוגה צלחת ב 840 XG למשך 2 דקות. דגירה את הצלחת למשך 30 עד 60 דקות ב RT. לשאוב את פתרון השטיפה מהבארות. לשטוף כל פעמיים גם כדלקמן: הוסף 1 מ"ל של PBS על כל טוב, צנטריפוגה את הצלחת ב 840 XG למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב PBS. 3. גיבוש hPSC אגרגטים פלייט microwell הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. מניחים לשטוף בינוני באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: נפח נדרש = 1 מ"ל x מספר בארות של HPSC כי יהיה ניתק. לנתק hPSCs תאים בודדים הערה: שלבים אלה מתארים את הניתוק של תאים בתרבית על 6 צלחות היטב – הכרכים מגיבים וניתן לשנותם באופן יחסי עבור פורמטי תרבות אחרים. לשאוב את המדיום תרבות מכל תרבות hPSC גם דיסוציאציה. יש לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה, ומיד לשאוב האנזים דיסוציאציה מכל טוב. הערה: אנזים דיסוציאציה שיורית צריך להספיק כדי לנתק את התאים. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הוסף 1 מ"ל של לשטוף בינוני זה טוב מכנית לנתק את התאים מפני השטח בתרבית רקמה על ידי pipetting וואש בינוני עם micropipettor P1000 על פני בתרבית רקמה. אם הניתוק שנראה גושים שלמים ותא להישאר, לעבור את ההשעיה דרך מסנן בנקודה זו. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ"ל ולאחסןהצינור בחממה בעוד שמספר התא מתבצע בשלב הבא. בצעו ספירת תאים: לקחת דגימת 10 μl של השעית התא שנאספה בשלב הקודם. הוסף 30 μl של Trypan כחול ומערבבים ההשעיה היטב על ידי pipetting. העבר 10 μl של Trypan כחול מוכתם תאים לכל מקום משכנו של hemocytometer ולדמיין תחת מיקרוסקופ הפוכה במטרה 10X. ספירת התאים. מתוצאות ספירת תאים, לחשב כמה בארות ניתן זורעים 1.2 x 10 6 תאים לכל גם צלחת microwell. חישוב צבירת בינוני נדרש זרע התאים ב 1 מ"ל לכל טוב. כן בינוני צבירה. לכל 10 מיליליטר של מדיום אינדוקצית לב מלא, להוסיף 0.5 μl של פתרון מניות BMP4 (ריכוז סופי = 0.5 ng / ml) ו- Y-27632 ROCK מונע (ריכוז סופי = 10 מיקרומטר). הסר את צינור חרוטי המכיל את hPSCs מן החממה centrifuge הצינור ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב את המדיום לשטוף ו resuspend התאים במדיום צבירה בצפיפות של 1.2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. לשאוב את הפתרון לשטוף PBS מבאר כל צלחת microwell. באמצעות micropipettor P1000, להפיץ זרע 1 מ"ל שווה של השעיה התא היטב כל על צלחת microwell. לזרע מספר רב של בארות, מעת לעת מערבולת השעית התא למנוע שיקוע. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 במשך 5 דקות. שים את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לאשר תאים טוו לתחתית של כל microwell. דגירה את הצלחת למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2, 5% O 2 (חוסר חמצן). 4. אינדוקציה הלב שלב 1 יום אחד לאחר צבירה (יום 1), להכין את נפח הנדרש בינוני אינדוקציה שלב 1 (24 צלחת היטב, נפח = 1 מ"ל x מספר בארות). עבור 1 מ"ל של שלמהבינוני אינדוקצית לב, להוסיף 1 μl של פתרון מניות BMP4 (ריכוז סופי = 10 ng / ml), 0.5 μl של פתרון מניות bFGF (ריכוז סופי = 5 ng / ml), ו -0.6 μl של Activin A (ריכוז סופי = 6 ng / מ"ל). מניחים את המדיום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפחות. הסר את צלחת microwell מן החממה. בדוק את אגרגטים תחת מיקרוסקופ. לעומת צבירה שלאחר צנטריפוגות מיד, הם צריכים להופיע שלמים עם קצוות חלקים (יותר עגול פחות מרובע מאשר יום קודם לכן). הסר את supernatant מבלי להפריע אגרגטים בתוך microwells: החזק את צלחת microwell אופקית ברמה (כלומר., לא להטות אותו). עבור כל טוב על צלחת microwell, הנח את הקצה של micropipettor P1000 על פני השטח של מדיום התרבות על קצה הבאר. לאט להסיר את המדיום, נזהר שלא להפריע המצרפים בתחתית של microwells. לאחר שהוריד tהוא ברמה בינונית לכ 1 עד 2 מ"מ מפני שטח microwell מרקם, לאט להטות את הצלחת לאסוף בינוני בצד אחד של הבאר (פעם העצמה נמוכה מספיק, בתנועה זורמת מופחתת במידה ניכרת וזה קל יותר להימנע אגרגטים מקבלים הרים מתוך microwells האישי שלהם). לאט פיפטה את המדיום הנותרים הבאר. כדי להוסיף בינוני אינדוקציה טריים שלב 1 תוך הקפדה על אגרגטים להישאר microwells האישיים שלהם: צייר 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה שלב 1 עם micropipettor P1000. החזק את קצה פיפטה כנגד הקצה הפנימי של הבאר לאט מאוד לוותר על המדיום אל הקיר הפנימי של הבאר. חזור על הבארות הנותרות. מחזיר את הצלחת אל האינקובטור בתנאי חוסר חמצן במשך 3 ימים. 5. אינדוקצית לב שלב 2 ביום 4, במקום לשטוף בינוני (נפח = מספר בארות x 2 מ"ל) באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות. הכן את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 2 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל): לכל מ"ל של מדיום אינדוקציה לב מלאה, להוסיף 2 μl של פתרון המניות VEGF (הריכוז הסופי = 10 ng / ml) ו -0.5 μl IWP-2 פתרון מניות (= 5 מיקרומטר ריכוז סופיים). מניחים את המדיום אינדוקציה מוכן שלב 2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, לקצור המצרפים מבאר כל צלחת microwell לאסוף את ההשעיה המצרפי צינור חרוטי 15 מ"ל (לאסוף עד 10 בארות לכל שפופרת 15 מ"ל). אפשר המצרף להתיישב במשך 15 דקות בתוך חממה היפוקסי. הערה: שלב זה חשוב להפריד תאים בודדים ופסולת הסלולר מן אגרגטים ללא פגע. לשאוב supernatant בזהירות resuspend המצרפים ב 10 מ"ל של בינוני מחומם מראש לשטוף כדי להסיר ציטוקינים אינדוקטיביים שיורית (למשל, Activin A הוא מולקולת איתות חזק אפילו שיתוף נמוך מאודncentrations). צנטריפוגה אגרגטים ב 50 XG למשך 2 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend המצרפים pelleted במדיום אינדוקציה 2 מחומם מראש. מעבירים את ההשעיה המצרפי מצורף אולטרה-נמוכה 24 גם צלחת (אולא) ב 1 מ"ל לכל טוב. שים המצרפים מתחת למיקרוסקופ כאחידות, צבירי תאים חזקים. דגירה בתנאי חוסר חמצן עד יום 6. 6. אינדוקציה הלב שלב 3 ביום 6, להכין את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 3 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל). עבור 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה לב מלאה, להוסיף פתרון המניות 2 μl VEGF (הריכוז הסופי = 10 ng / ml), ו -0.5 μl של פתרון מניות bFGF (ריכוז סופי = 5 ng / ml). מניחים בינוני אינדוקציה שלב 3 מוכן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 15 דקות. השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות להעביר את אגרגטים ל -15 מ"ל צינורות חרוטי, איגום עד 10 מ"ל של המצרפיים לכל צינור. אפשר 10 דקות עבור אגרגטים להתיישב. לשאוב supernatant ו resuspend המצרפים במדיום אינדוקציה שלב 3 מחומם מראש. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, להפיץ מחדש המצרפים לתוך צלחת 24 גם אולא ב 1 מ"ל לכל טוב. ביום 10, להכין את הנפח של בינוני אינדוקציה שלב 3 (נפח = מספר בארות x 1 מ"ל) לפי שלב 6.1. השתמש פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות להעביר את אגרגטים ל -15 מ"ל צינורות חרוטי, איגום עד 10 מ"ל של אגרגטים לכל צינור. אפשר 10 דקות עבור אגרגטים להתיישב. לשאוב supernatant ו resuspend המצרף בשלב 3 אינדוקציה בינונית. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, להפיץ מחדש המצרפים לתוך צלחת 24 גם אולא ב 1 מ"ל לכל טוב. דגירה בתנאי חוסר חמצן במשך ימים. ביום 12, להתחיל דוגרי התאים ברמות חמצן normoxic לשארית תקופת התרבות (37 ° C, 20% O 2, 5% CO 2). הערה:לאחר נקודת זמן זו, תאים הם כבר לא מתורבתים בתנאי חוסר חמצן. חזור על חילופי בינוני מלא זה (שלבי 6.2 ו -6.3) כל 4 ימים, החלו ביום 14 עד קציר תאים (בדרך כלל, ריכוזי cardiomyocyte שיא נצפים לאחר יום 14 של בידול). 7. ניתוח cytometry זרימה של Cardiac Troponin T (cTnT) תדירות הביטוי של פלט תרבות microwell לנתק את אגרגטים כדלקמן: השתמש פיפטה סרולוגיות 5 מ"ל להעביר 1 גם של אגרגטים על צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה אגרגטים ב 50 XG למשך 2 דקות ובזהירות לשאוב supernatant. הוסף 1 מ"ל של טרי מומס 1 מ"ג / מ"ל ​​Collagenase פתרון Type II כדי המצרפים. מעבירים את ההשעיה המצרפי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. דגירה אגרגטים Collagenase Type II הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, השתמש micropipettor P1000 בעדינות כדי לנתק את אגרגטיםלתוך השעית תא בודדת הומוגנית. אם המצרפים לא לנתק בקלות, ליישב את אגרגטים, לשאוב supernatant, דגירה אגרגטים 700 μl של אנזים דיסוציאציה 1 עד 2 דקות ב RT. בעדינות פיפטה המצרפים 1 עד 2 פעמים עם micropipettor P1000 לנתק. לדלל את אנזים דיסוציאציה: הוסף 700 μl של שטפי בינוני המכיל 14 μl של 1 מ"ג / פתרון המניות DNAse מ"ל. לקחת דגימה 10 μl לבצע ספירת תאים, צנטריפוגות ההשעיה הנותרים באמצעות microcentrifuge הספסל העליון ב XG 300 במשך 2 דקות. בצע ספירת תאים: כתם מדגם הספירה 10 μl עם נפח שווה של כחול Trypan ולספור באמצעות hemocytometer. הסר את צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את התאים הנותרים מן microcentrifuge. לשאוב supernatant ו resuspend התאים, בריכוז של 200,000 ל -500,000 תאים לכל 100 μl, ב הנקס מאוזן תמיסת מלח המכיל2% בסרום שור עוברי (HF). עבור כל תנאי, להעביר 100 μl של ההשעיה תא לכל היטב 2 בארות של צלחת 96-היטב (גם אחד יהיה מוכתם עם נוגדן cTnT והשני יהיה שליטה נוגדנים משני). צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant עם micropipettor רב. תקן את התאים: הוספת 200 μl של פתרון קיבוע (רכיב בערכה) לכל היטב דגירת הצלחת במשך 15 דקות ב RT. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. השתמש micropipettor רב כדי למשוך את supernatant בזהירות מבארות. השלך את supernatant מיכל פסול paraformaldehyde. לשטוף את התאים הקבועים פעמים: הוספת 200 μl של HF היטב כל אחד. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות. לשאוב supernatant, וחזור על השלב לשטוף פעם נוספת. תאים קבועים ניתן לאחסן עד שבוע ב HF על 4 מעלות צלזיוס. Permeabilize התאים: צנטריפוגה את הצלחת ב 300XG למשך 2 דקות. הוספת 100 μl של פתרון Permeabilization (רכיב בערכה) היטב כל דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 XG למשך 2 דקות ו לשאוב supernatant. להכין תערובת אמן אנטי-cTnT ב HF בריכוז האופטימלי עבור ממספרת נתון (הדילול האופטימלי צריך להיקבע על ידי טיטרציה ובדרך כלל נע בין 1: 500 עד 1: 2,000). עבור כל תנאי (2 בארות לכל מצב), להוסיף 100 μl של מיקס מאסטר גם אחד (מדגם מוכתם) ו -100 μl של HF הרגיל לבאר האחרים (שליטת נוגדנים משני). דגירת התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 200 μl של HF לכל טוב. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. להכין תערובת מאסטר של נוגדנים משני. העבר בהיקף של HF שמקביל 100 μl לכל היטב (שליטה נוגדנים משניcTnT מוכתם) מטופלת. הוסף 1 μl של נוגדנים משני אנטי עכבר APC עז לכל 200 μl של HF (1: 200 דילול). כתם הדגימות. הוספת 100 μl של פתרון מכתים היטב כל (הן את השליטה נוגדנים משני ובארות אנטי cTnT מוכתם). דגירה תאים בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (לשמור על צלחת מכוסה או בחושך לאחר הוספת נוגדנים משני ניאון כדי להימנע photobleaching). צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 200 μl של HF לכל טוב. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. העברת דגימות 5 מ"ל עגול זרימת התחתונה cytometer צינורות ניתוח ולבצע cytometry הזרימה עבור האות בערוץ APC באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור המכשיר 19.