在微孔聚集尺寸优化人类多能干细胞的基于悬浮心脏分化

1.培养基成分制备准备洗涤介质。每100毫升的DMEM / F12的，加入1ml 100×青霉素/链霉素（青霉素/链霉素）的1毫升100倍的L-谷氨酰胺和5毫升血清更换。 根据制造商的说明制备化学上确定的基础心肌诱导培养基。 准备以下股票试剂媒体表示，将在本协议中使用。 L型抗坏血酸：在锥形管中准备的5毫克每毫升的储备溶液在4℃，无菌超纯蒸馏水。 离开在冰上该溶液中，周期性地涡管，直到溶质完全溶解。过滤-消毒用0.22微米注射器过滤器的抗坏血酸溶液。 制备抗坏血酸溶液的1ml等份和这些等分试样在-20℃下储存。使用新鲜解冻等分试样每次培养基制备。 在媒体准备的一天，在1毫升心脏基础诱导培养基中稀释13微升一硫代（MTG）的。丢弃未使用的稀释MTG。 制备转（30毫克/毫升）的1ml等份在-20℃储存。储存在4℃下解冻等分长达3个月。 制备含有0.1％牛血清白蛋白（BSA）4mM的盐酸（HCl）。在通风橱中，加入30微升的6.0当量盐酸溶液至50ml超纯蒸馏水。过滤-消毒用0.22微米注射器过滤该溶液。加入2ml 25％BSA溶液加到50ml的HCl溶液。 制备含有0.1％BSA磷酸缓冲盐水（PBS）中。加入20μl的每毫升PBS中的25％BSA溶液。 准备人骨形态发生蛋白4（BMP-4）原液（10毫微克/微升）。溶解为10μg冻干的BMP-4的1ml的含有0.1％BSA的4mM HCl缓冲溶液。制备50微升等分试样在-20℃储存。 准备人类成纤维细胞生长因子2（bFGF）的原液（10毫微克/微升）。在含有0.1％BSA1毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）中溶解为10μg冻干的bFGF。制备50微升等分试样在-20℃储存。 准备人血管内皮生长因子（VEGF）原液（5纳克/微升）。溶解5微克冻干VEGF在1ml的PBS含有0.1％BSA。制备50微升等分试样在-20℃储存。 准备激活素原液（10毫微克/微升）。溶解10微克在1ml PBS中冻干活化素A含有0.1％牛血清白蛋白（BSA）。制备50微升等分试样在-20℃储存。 制备的Wnt生产-2（IWP-2）储备溶液（10毫摩尔）的抑制剂。溶解2mg的IWP-2在429微升二甲基亚砜（DMSO）中。制备10微升等分试样在-80℃下储存。 准备完整的心脏诱导培养基。到100ml基础心肌诱导培养基的，加入1ml 100×青霉素/链霉素的1毫升100倍的L-谷氨酰胺，500微升转的，1毫升刚解冻的抗坏血酸，和300微升的MTG。丢弃未使用的网上平台。 2.微孔板的制备注意：所有步骤应在生物安全柜中进行。 将0.5ml漂洗溶液（盒成分），这将在平板上可使用每个孔中。以确保该溶液接触各微孔内的整个面上，离心板在840×g离心2分钟。 将培养板在室温30〜60分钟。 从孔中吸出漂洗溶液。在840×g离心2分钟1ml的PBS添加到各孔中，离心平板，然后吸出PBS：洗各孔两次如下。 3. HPSC形成聚集体的微孔板注意：所有步骤应在生物安全柜中进行。 将洗涤介质在37℃水浴。 注：卷所需马力井= 1毫升×号SC将解离。 分离hPSCs单细胞注意：这些步骤描述6孔板中培养细胞的分离 – 试剂卷可以按比例对不同的文化形式进行缩放。 从每个HPSC培养以及用于解离吸出培养基。用1ml解离酶的冲洗每个孔，然后立即吸来自每个解离酶良好。 注：残余离解酶应足以解离的细胞。 孵育在37℃的板3分钟。 1毫升洗涤介质添加到每个孔中，并通过用P1000移液器在组织培养表面吹打洗涤介质机械解离从组织培养表面上的细胞。如果离解似乎是不完整的，细胞团块保持，通过在这点上一个过滤通过悬浮液中。 细胞悬液转移到15毫升锥形管中并储存在孵化器中的管，而细胞计数在下一步骤中进行。 进行细胞计数： 采取在前面步骤中收集的细胞悬浮液的10微升样品。加入30微升台盼蓝和吹打混合悬挂好。 转移10微升台盼蓝染色的细胞对血球的各腔室，并与10倍物镜的倒置显微镜下可视化。计数细胞。 从细胞计数结果，计算有多少井可以在每微孔板的井1.2×10 6个细胞接种。计算所需的聚合中的种子细胞以每孔1毫升准备集合中。每10毫升完整心脏诱导培养基，加入0.5微升BMP4原液（终浓度= 0.5纳克/毫升）和Y-27632 ROCK抑制剂（最终浓度=10μM）。 删除含有从孵化器和centrifu的hPSCs锥形管GE的管中，在200×g离心5分钟。吸出洗涤介质和悬浮在聚合介质中的细胞以每毫升1.2×10 6个细胞的密度。 吸从微孔板的每个孔的PBS洗涤溶液中。使用P1000移液器，均匀地分布和种子将1ml细胞悬浮液以每孔在微孔板。种子的大量井，周期性地涡细胞悬浮液，以防止沉降。 离心板在200×g离心5分钟。观察在显微镜下板以确认细胞已纺成各微孔的底部。 在一个5％CO 2，5％O 2（ 缺氧 ）培养箱培养24小时的板在37℃。 4.心脏感应第1阶段一天以下聚合（第1天），制备第1阶段诱导介质的需要的体积（对于24孔板孔中，体积= 1毫升×号）。 1毫升完整心肌诱导培养基中，添加1微升BMP4原液（最终浓度= 10毫微克/毫升），0.5微升的bFGF原液（最终浓度= 5纳克/毫升），和0.6微升活化素A（终浓度= 6纳克/毫升）中。放置在37℃水浴中的介质为至少15分钟。 从孵化器中取出微孔板。检查显微镜下聚集体。比起立时离心机后聚集，他们应该会出现完整的边缘平滑（更圆，较前一交易日平方米以下）。 而不干扰微孔内的聚集体除去上清： 横握微孔板水平（ 即 ，不能倾斜）。每孔上微孔板，放置P1000移液器的尖端在培养基的表面上，并针对井的边缘。 慢慢松开介质，小心不要在微孔底部扰乱聚集。减少to后他介质水平以从该纹理化微孔表面约1至2毫米，慢慢倾斜板在井（一侧收集介质后的体积是足够低的，流体运动大大降低，这是更容易避免聚集体得到解除他们的个人微孔）。慢慢吸取出在阱剩余介质。 要添加新的阶段1诱导培养基，同时确保骨料留在自己的个人微孔：绘制1阶段诱导培养基毫升用P1000微量。持枪头靠在孔的内侧边缘和非常缓慢地分配对井的内壁的介质。重复其余孔中。 返回板的孵化器低氧条件下3天。 5.心脏感应阶段2 在第4天，地点洗涤介质在37℃的水浴（体积=数井×2毫升）中至少15分钟。 准备阶段2诱导培养基（体积=井×1毫升数）的必要量：每毫升完整心脏诱导培养基，加入2微升的VEGF的储液（最终浓度= 10毫微克/毫升）和0.5微升IWP-2储备溶液（最终浓度= 5微米）。放置在37℃水浴中制备的第2阶段的诱导培养基中至少15分钟。 使用5ml的血清吸管，从微孔板的每个孔收获聚集体，并收集在15毫升的总悬浮液的锥形管（收集高达每15ml试管10孔）。 允许聚集在缺氧培养箱沉降15分钟。 注：该步骤是重要的，以单细胞和细胞碎片从完整聚集体中分离出来。 小心吸出上清液和重悬在10毫升的预温洗涤介质的聚集体以除去残余的电感的细胞因子（ 例如 ，激活素A是即使在非常低共一个有力的信号分子ncentrations）。 离心的聚集体，在50×g离心2分钟。吸出上清液。重悬在预温热诱导2中的丸状聚集体。 以每孔1毫升转移聚合悬浮液至24孔超低附件（ULA）板。观察显微镜均匀，致密细胞簇下的聚集。 缺氧条件下孵育直到下午6一天。 6.心脏诱导第3阶段在第6天，制备第3阶段诱导培养基（体积=井×1毫升数）的必要量。 1毫升完整心脏诱导培养基，加入2微升的VEGF原液（最终浓度= 10毫微克/毫升），和0.5微升的bFGF原液（最终浓度= 5纳克/毫升）。放置在37℃水浴中制备第3阶段诱导培养基为至少15分钟。 使用5ml的血清吸管到聚集体转移到15ml锥形管中，汇集高达10毫升聚合每人S管。 允许聚集体沉降10分钟。吸出上清液，并在预热阶段3诱导培养基悬浮聚集体。使用5毫升血清吸管，重新分配聚集成一个24孔ULA板，每孔1毫升在第10天，制备第3阶段诱导培养基如每步6.1（体积=井×1毫升数）的必要量。 使用5ml的血清吸管到聚集体转移到15ml锥形管中，汇集高达10毫升，每管集合体。 允许聚集体沉降10分钟。吸出上清液，并在第3阶段诱导培养基悬浮聚集体。使用5毫升血清吸管，重新分配聚集成一个24孔ULA板，每孔1毫升在低氧条件下孵育两天。在第12天，开始在含氧量正常的氧含量孵育细胞的培养期间的剩余（37℃，20％O 2，5％的CO 2）。 注意：该时间点后，将细胞不再低氧条件下培养。 重复此完全培养基交换（步骤6.2和6.3），每4天，开始14天直到收获细胞（通常是心肌峰值浓度分化的第14天观察后）。 心肌肌钙蛋白T（cTnT）的微孔文化输出的频率表达7.流式细胞仪分析解离的聚集体如下： 使用5ml的血清吸管1以及聚集体转移到15毫升锥形管中。离心的聚集体，在50×g离心2分钟，并小心地吸出上清液。 1毫升新鲜溶解1毫克/毫升胶原酶II型溶液加入到聚集体。转移聚合悬浮到1.5ml微量离心管中。孵育在胶原酶II聚集物在室温下过夜。 次日，使用P1000移液器轻轻分离骨料成均匀的单细胞悬浮液。如果聚集体不容易解离，沉降聚集体，吸出上清液，并孵育在700微升解离酶的聚集体为1至2分钟，在室温。轻轻地用P1000移液器以解离吸取聚集体1至2次。 稀释的离解酶：添加700μl的洗涤介质的含有14微升的1毫克/毫升DNA酶原液。取10微升样品在300 xg离心进行细胞计数，并离心使用台式微量剩余的悬浮液2分钟。 进行细胞计数：用等体积的台盼蓝的染色10微升计数样品并用血细胞计数器计数。 删除包含从离心剩余的细胞1.5 ml离心管。吸出上清液，重悬细胞，以每100微升200,000至500,000个细胞的浓度，在Hanks平衡盐溶液含2％胎牛血清（HF）。 对于各条件，转移细胞悬液每孔100μl到2孔96孔板（一个孔将与cTnT的抗体染色，并另将二级抗体对照）。 离心板在300×g离心2分钟。删除与多通道移液器将上清液。 固定细胞：加入200μl每孔固定溶液（试剂盒成分）和孵化板在室温下15分钟。 离心板在300×g离心2分钟。使用多通道移液器从孔中小心撤回上清液。在处置一个多聚甲醛废物容器上清。 洗固定细胞两次：添加200μl的HF与每个孔中。离心板在300×g离心2分钟。吸出上清液，并重复该洗涤步骤一次。固定的细胞可以在4℃保存用于在高频长达一周。 通透的单元格： 离心300板xg离心2分钟。 添加100μl的透液（试剂盒成分）到每个孔中，并孵育在室温下将板5分钟。 离心板在300×g离心2分钟，吸出上清液。 在对于给定批号的最佳浓度制备抗肌钙蛋白T短波一个主混合物（最佳稀释必须通过滴定来确定，并且通常范围从1：500至1：2000）。 每个条件（每个条件2孔），添加100微升主混合物到一个孔（染色样本）和100微升纯HF与其他井（二次抗体对照）。孵育细胞在4℃下进行30分钟。 离心细胞，在300×g离心2分钟。吸上清，每孔加入200微升HF的。重复该洗涤步骤一次。 制备二级抗体的一个主混合物。转移HF的体积对应于100微升的每个井（二次抗体的控制和肌钙蛋白染色）正在接受治疗。加入1μl每200微升的HF的山羊抗小鼠-APC第二抗体（1：200稀释）。 染色样品。加入100μl的染色溶液至每孔（两个次级抗体对照和抗肌钙蛋白染色孔）。孵育细胞在黑暗中在4℃下进行30分钟（保持覆盖的板或在黑暗中加入荧光二级抗体后，以避免光漂白）。 离心细胞，在300×g离心2分钟。吸上清，每孔加入200微升HF的。重复该洗涤步骤一次。 转移样品至5毫升圆底流式细胞仪分析管，并使用标准协议为仪器19中的APC通道流式细胞执行对信号流。