إجمالي الحجم الأمثل في Microwells لالقائم على تعليق القلب تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية
Summary
الأساليب التقليدية لبدء التمايز القلب تعليق مجموع المباراتين على أساس من المحفزة الإنسان ينبع الخلايا (hPSCs) تعاني مع عدم تجانس الثقافة فيما يتعلق حجم الكلي والشكل. هنا، نحن تصف طريقة قوية للتمايز القلب توظيف microwells لتوليد تسيطر عليها حجم hPSC المجاميع مثقف في ظل الظروف التي تشجع القلب.
Abstract
Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.
Introduction
في زراعة الخلايا في المختبر يمكن أن يؤديها في إطار عدد من الطرائق، ولكن يتم عادة إما في ظروف ملتصقة ثنائية الأبعاد أو في ظروف تعليق ثلاثية الأبعاد أن ألخص بشكل كامل في أنظمة الجسم الحي. ونتيجة لذلك هناك اتجاه متزايد في العديد من مجالات البحوث لتطوير طرق فعالة لتوليد بنيات الأنسجة ثلاثية الأبعاد. في سيناريوهات حيث تتطلب أنواع وعمليات الخلية الداعمة المصفوفة خارج الخلية (ECM) السطحية والتصاق الإشارات، ويمكن تطبيق ثلاثي الأبعاد الثقافة عبر بنيات scaffolded، حيث الخلايا مثقف أو في خارجية المنشأ دعم مصفوفة 1. ويمكن إجراء الخلايا والعمليات التي لا تتطلب الانضمام إلى مصفوفة داعمة في تعليق كأنظمة unscaffolded تتألف أساسا أو حصرا من الخلايا (التي قد ثم المضي قدما لتوليد مصفوفات الذاتية الخاصة بهم) 2،3. هنا، نقدم بروتوكول للالقلب التمايز سالخلايا الجذعية المحفزة الإنسان و (hPSCs – الخلايا الجذعية قادرة على أن تصبح أي نوع من الخلايا في الجسم، سواء كانت من مصادر الجنينية أو غيرها) في والزي الرسمي، وحدات unscaffolded التي تسيطر عليها الحجم.
وتشهد التفريق بين hPSCs كما المجاميع التعليق من الاختلافات الكبيرة في حجم الكلي سواء داخل تشغيل وبين أشواط. هذا التباين هو نتيجة للطريقة وعادة ما تستخدم لتوليد هذه المجاميع، والذي ينطوي على التفكك الميكانيكي للمستعمرات الخلايا. للحد من هذه التقلبات، وقد تم استخدام عدد من الأساليب للسيطرة على عدد من الخلايا في مجموع المباراتين وكذلك القطر الكلي والتوحيد. ومن الأمثلة على ذلك تشكيل المجاميع في أنابيب microcentrifuge 4 أو كما شنقا قطرات 5، micropatterning تعريف ثنائية الأبعاد المستعمرات hPSC 6 ومن ثم يمكن نقلها إلى تعليق، أو الطرد المركزي من الخلايا في U- أو لوحات-V أسفل متعددة جيدا 7،8، 9. ومع ذلك، كل هذه apprتقتصر oaches من الإنتاجية المنخفضة على توليد الكلي. النظم القائمة جيدا تستخدم نهجا مماثلا لأنظمة لوحة-V أسفل، ولكن حجم أصغر من microwells (في هذا البروتوكول كل وجود عرض من 400 ميكرون) يمكن توليد أعداد أكبر من المجاميع موحدة من ثقافة لوحة واحدة بشكل جيد (القطر القياسي لل~ 15.5 ملم تحتوي على ~ 1200 microwells) من شأنه أن تتولد من-V السفلي كلها لوحة 10. وقد استخدم تشكيل الكلي مقرها أيضا في عدد من الإعدادات بما في ذلك التفريق بين hPSCs إلى الأدمة 11، الأديم الباطن 12، أرومية متوسطة 13 و 14 خارج الجنين مصائر. تكون الغضروف من خلايا الجذعية الوسيطة 15؛ جيل من ركائز موحدة لفحص السمية 16؛ والتحقيق في ميكانيكا الأحياء 17.
واحد تحديا كبيرا في تطوير بروتوكولات صناعة قوية لإنتاج cardiom المستمدة hPSC-وقد yocytes عدم وجود استنساخ في كفاءة التمايز القلب بين أشواط. أثبتنا سابقا أن هذا التغير يمكن أن يعزى إلى عدم التجانس في السكان hPSC ابتداء، والتي تضم كل من خلايا hPSCs والتفريق تجديد الذات التي تعبر عن الجينات المرتبطة الأديم الباطن والعصبية التمايز 6،18. الإشارات التي يفرزها هذه الخلايا التفريق تؤثر تحريض القلب. على وجه التحديد، الأديم خارج الجنين يعزز تحريض القلب، في حين تمنع الأسلاف العصبية تحريض القلب. على hPSC التجميع، الخلايا داخل يفرق الكلي وتنظيم بحيث تحيط hPSCs غير متمايزة طبقة من خلايا الأديم خارج الجنين التي تضع على السطح الكلي 13. من خلال التحكم في حجم الكلي، ونحن يمكن أن تعدل نسبة الخلايا الأديم الباطن الذي يحفز القلب على hPSCs غير متمايزة (مساحة السطح إلى نسبة الحجم) وتحسين هذه النسبة لأقصى قدر من الحث القلب 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد لوحظ أن التمايز القلب كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة هي عملية شديدة التباين. وفي حين أنه ليس من المستغرب أن خطوط مختلفة من الخلايا يحمل نزعات مختلفة للقدرة التمايز إلى أنواع معينة من الخلايا، فقد لوحظ أن كفاءة التمايز القلب يتقلب بشكل كبير بين تكرار يدير باستخدام نفس خط 6 خلايا. بروتوكول الموصوفة هنا يتناول مصدر رئيسي واحد من هذا التغير عن طريق التحكم مباشرة في عدد الخلايا مساهمة في مجموع المباراتين. لمزيد من خفض التباين بين أشواط، فمن المستحسن أن خطوط hPSC تكييفها لالركض خلية واحدة تستخدم، حيث إن هذا النوع من توسعة وصيانة النتائج hPSC في السكان المحفزة أكثر اتساقا مع الاحترام لترددات التعبير عن علامات تعدد القدرات (على سبيل المثال، Oct4، NANOG، هيئة تنظيم الاتصالات-1-60، الخ.).
البروتوكول كما هو مكتوب هنا يحدد حجم الكلي من 1000 الخلايا للسالحث القلب ptimal من الجنينية خط الخلايا الجذعية HES-2. لتطبيق هذا البروتوكول على خطوط مختلفة من الخلايا، فمن الأهمية بمكان أن يتم إجراء شاشة الأولية حجم الكلي لتحديد الحجم الأمثل الكلي خلية خط معين. في حين أنها لا تؤثر بشكل مباشر على الإجراءات الواجب اتباعها هنا، أن نذكر القارئ أن التغيرات في حجم الكلي وكثافة الخلايا الشاملة من المتوقع أن تؤثر على تسليم الأكسجين. قد يصبح هذا عاملا مهما في التطبيقات المصب. بالإضافة إلى ذلك، أفكارك موت الخلية هو مصدر قلق خلال تفكك hPSCs إلى الخلايا وحيدة. لذا، فمن الأهمية بمكان لضمان المانع ROCK موجودا خلال تجميع خلية القسري في microwells. وأخيرا، فمن الأهمية بمكان أن يوم 4 من التمايز المجاميع يتم غسلها جيدا لإزالة أثر Activin A، موجودة في متوسط التعريفي 1، قبل إعادة تعليق في الحث 2 متوسط. بعد يوم 4 من التمايز، Activin ويعزز الأديم التمايز على حساب المتوسطديرم تحريض 20.
التطبيق الرئيسي من هذه التقنية هو لفحص الأحجام الإجمالية التي تعزز التفرقة القلب كفاءة. ومع ذلك، واحدة من القيود المفروضة على تقنية الحالية هو أنه يمثل تحديا لتوسيع نطاق إنتاج القلب إلى المستويات ذات الصلة سريريا باستخدام لوحات microwell. ويتم على نطاق وتتكون من التمايز القلب عادة في ظروف ثقافة السائبة في المفاعلات الحيوية تعليق أثار 21. لذلك، مرة واحدة تم استخدام نظام microwell لتحديد نطاقات مقبولة من حجم الكلي لتحريض القلب كفاءة، فإن الخطوة التالية لزيادة هي تحديد سرعات مفاعل حيوي المكره التي يمكن أن تولد المطلوب حجم الخلية مجموع المباراتين.
أحد الفروق الهامة لهذه التقنية فيما يتعلق بأساليب أخرى للتمايز القلب مقرها الكلي، غير أنه يمكن التحقيقات المباشرة في تحوير آثار إشارات الذاتية في المجاميع وكذلكالثقافة المشتركة من أنواع الأنسجة الاستقرائي / المثبطة مع hPSCs في الكلي 13. هذه الأنواع من التحقيقات يمكن أن تبلغ تطوير عملية الإنتاج القلب على نطاق واسع.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.
Materials
| Biological safety cabinet | |||
| Pipette aid | |||
| Serological pipettes (5 to 25 mL) | |||
| Aspirator | |||
| Aspirator or Pasteur pipettes | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| Fume hood | |||
| 0.22 µm syringe filter | |||
| 5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
| 5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
| Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
| P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
| Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
| Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Bench-top microcentrifuge | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Vortex | |||
| Ice | |||
| -20C freezer | |||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
| StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
| Transferrin | Roche | 10652202001 | |
| BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
| bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
| VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
| Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
| IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| 100X L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
| Hemocytometer | |||
| Trypan Blue | |||
| Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
| Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
| 96 well plate (for FACS staining) | |||
| Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
| cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
| goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
| 5 mL round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |
Referencias
- Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
- Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
- Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
- Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
- Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
- Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565 (2008).
- Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
- Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
- Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
- Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
- Ungrin, M., O’Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).
