소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열
Summary
A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.
Abstract
Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.
Introduction
Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 클로로 트리 아진 염료를 기반으로 멀티 CPH과 ICB 기판의 새로운 세대 (표 1의 기판의 전체 목록)을 사용하여 사용자 정의 설계 상업 분석 키트에 배치. 기질의 효소 소화 분석 용액 중의 검출하고 플레이트 리더 (9)를 사용하여 정량화 될 수있는 작은 가용성 염색 제품을 산출한다. 이 분석은 엔도 -acting 효소의 평가 및 분석의 감도 설계하는 다른 방법은 효소 엑소 -acting 11,12 가능한 반면 azurine 가교 (AZCL)를 사용 하나, 기판들 (10)과 유사하다. CPH뿐만 아니라 ICB 기판은 엑소 가장 가능성 -enzymes 의해 분해되지만큼 상기 분석 키트의 한계 때문에 염료 및 가교제 분자 (8)에서 발생하는 입체 장해에 엔도 -enzyme 활성의 검출에있다.
상기 분석은 96 아 행한다리터 형식과 개별 반응은 우물에서 이루어집니다. 반응물을 재현 데이터를 수신하도록 상기 플레이트에 혼합되어야한다. 얻어진 상층 액을 각 웰의 흡광도를 흡광 분석법을 이용하여 정량화 될 수있는 제품 판으로 필터링된다. 기본 원리 및 분석의 레이아웃이 분석은 기판을 갖는 분석 플레이트 (96 웰 필터 플레이트)로 구성된다.도 1에 도시되고, 효소와 인큐베이션 한 후, 상등액을 명확 웰 플레이트에 통해 여과되고 와 흡광도는 효소의 특이성 및 활동의 반 정량적 측정을 제공 읽습니다. CPH 기판을 사용하여이 스크리닝 분석법은 또한 수용성 반응 생성물 밤새 배양 후에 착색 할로 생성 한천 플레이트 형식으로 사용될 수 있음을 또한 도시하고있다. (8)
에서 입증 된 바와 같이 분석 키트는 정제 된 효소와 그들의 잠재력 측면 활동을 선별하는 데 사용할 수 있습니다도 2. 사이드 활동 번의 효소 및 무차별 특이성에서뿐만 아니라 분석 된 샘플은 상이한 효소 혼합물 및 시너지 효과를 연구 할 필요가 있다는 사실로부터 발생할 수있다. 이 이전의 연구에 도시 된 바와 같이 또한, 곰팡이 8뿐만 아니라 내인성 식물 효소 및 박테리아 (미발표)으로부터 효소 칵테일 장내 미생물 (13) 및 배양 브로스를 효소 원으로서 사용할 수있다.
ICB 기판은 종종 미생물 붕괴 산업 공정에서 발생 세포벽 성분의 복합 혼합물을 다룬다. 이 기판은 다당류의 유용성을 평가하고 효과적으로보다 효율적으로 분해 출력 저하 칵테일을 최적화하는 방법에 대한 정보를 제공하도록 설계되었습니다. 그림에 나타낸 바와 같이 3 CPH 및 ICB 기판 측에 의해 효소 심사 측에서 사용할 수 있습니다 – 효소 특이성에 대한 풍부한 정보를 공개바람직한 기판 (CPH)보다 가깝게 자연 (ICB)에서 발견되는 거대 분자 어셈블리를 모방 바람직한 기판 이외에 다른 성분을 포함하는 자연적인 복잡한 컨텍스트 모두 D 작업. 여러 색상의 사용은 분석의 높은 처리량을 증가 multiplexity 여러 가지 기질에 대한 효소 활성을 동시에 검출 가능하다. 다른 염료의 스펙트럼은 단순 회귀 분석에 의해 기판 및 다중 활동 형 육안으로 관찰 할 수있는 대부분의 경우에 해결 될 수있다. 이러한 실험 및 그 결과의 시뮬레이션 예는도 4에 도시되어있다.
이 분석 도구 및 응용 프로그램의 다양성을 잘 알 수없는 활동 효소와 문화 국물의 첫 번째 수준의 검사에 적합하다. 이 분석에서 가장 중요한 특징은 높은 처리량 사이트, 맞춤화, 사용의 간편성과 유연성이다. 그 마음에, w로전자 도구의이 소설 세트가 크게 개선하고 산업의 효소 심사 과정뿐만 아니라 학문적 응용 프로그램을 빠르게 것이라고 믿는다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우수한 기술 지원을 촬영에 대한 자신의 실험실에 대한 액세스를 제공하는 교수 J. 폴 녹스 (리즈 대학, 영국), 수잔 E. 마커스에게 감사의 말씀을 전합니다. JS는 WallTraC 프로젝트 (유럽위원회 (European Commission) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (보조금 계약에는 인정하지 :. 263916)와 21 세기를위한 프로젝트 바이오 매스 (혁신 재단 덴마크, 사건 번호 : 103408)를 SKK가 SET4Future 프로젝트 (덴마크어 전략 연구위원회)를 감사하고, 전략 연구, 기술 및 혁신 (그랜트 케이스 번호 : 0603-00522B)에 대한 덴마크위원회에 대한 덴마크 의회에 의해 설립 된 바이오 값 전략 및 복합 다당류 시스템 (그랜트 케이스의 효소 분해를 이해하는 생물학 중심의 접근 없음 . :. 자금 107279)는이 논문은 저자의 의견을 정확하게 반영 유럽 연합 (EU)은 여기에 포함 된 정보로 제조 될 수있는 사용에 대한 책임을지지 않습니다..
Materials
| assay kit plates | Glycospot | customized assay kit plates | |
| activation solution | Glycospot | for activating CPH substrates | |
| 350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold | Pall Corporation | 5015 | spacer block |
| 96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile | Millipore | MSHVN4510 | assay plate |
| 96-Well Microplates, Polypropylene | Greiner Bio-One | 651201 | collection plate after washing the substrates |
| Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates | Thermo Scientific | 269620 | product plate |
| Diaphragm pump MZ 2 NT | Vacuubrand | 732000 | vacuum pump used with the vacuum manifold |
| Infors HT Ecotron | Infors HT | 4950132 (Buch & Holm) | horizontal shaker |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | 10067-750 (VWR) | 96-well plate absorbance reader |
| Vacuum manifold | Pall Corporation | 5017 | vacuum manifold |
| endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) | Megazyme | E-CELTR | cellulase [cel] |
| endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) | Megazyme | E-BMACJ | mannanase [man] |
| endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) | Megazyme | E-LAMSE | β-glucanase [glu] |
| endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) | Megazyme | E-EGALN | galactanase [gal] |
| endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger) | Megazyme | E-XYAN4 | xylanase [xyl] |
| endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) | Megazyme | E-XEGP | xyloglucanase [xg] |
| α-amylase (Bacillus licheniformis) | Megazyme | E-BLAAM | amylase [amy] |
Referencias
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