Funktionell karaktärisering av regulatoriska makrofager som inhiberar graftreaktiv immunitet
Summary
Makrofager är plastceller i det hematopoietiska systemet som har en avgörande betydelse för skyddande immunitet och homeostas. I denna rapport beskriver vi optimerade in vitro- tekniker för att fenotypiskt och funktionellt karakterisera transplantatinfiltrerande regulatoriska makrofager som ackumuleras i det transplanterade organet under tolerogena förhållanden.
Abstract
Makrofagackumulering i transplanterade organ har länge erkänts som ett kännetecken för avstötning av allograft 1 . Immunogena monocyter infiltrerar allograftet tidigt efter transplantationen, monterar ett transplantatreaktivt svar mot det transplanterade organet och initierar organavstötning 2 . Nya data tyder på att undertryckande makrofager underlättar framgångsrik långsiktig transplantation 3 och är nödvändiga för induktion av transplantationstolerans 4 . Detta föreslår ett flerdimensionellt koncept av makrofag ontogeni, aktivering och funktion, vilket kräver en ny färdplan för isolering och analys av makrofagfunktion 5 . På grund av makrofas plasticitet är det nödvändigt att tillhandahålla en metod för att isolera och karaktärisera makrofager, beroende på vävnadsmiljö, och att definiera sina funktioner enligt olika scenarier. Här beskriver viVara ett protokoll för immunkarakterisering av transfigurerande makrofager och metoderna som vi använde för att funktionellt utvärdera deras förmåga att hämma CD8 + T-proliferation och för att främja CD4 + Foxp3 + Treg-expansion in vitro .
Introduction
Detta protokoll beskriver in vitro- tekniker för att studera funktionen av vävnadsinfiltrerande makrofager isolerade från hjärt-allotransplantat, i enlighet med deras förmåga att modulera T-cellreaktioner. Bredt beskrivet i litteraturen är fluorescerande cellspårningsfärger i kombination med flödescytometri kraftfulla verktyg för att studera den undertryckande funktionen hos specifika celltyper in vitro och in vivo. Vårt protokoll följer karboxifluoresceinsuccinimidylester (CFSE) -metoden för övervakning av lymfocytproliferation in vitro .
När en CFSE-märkt cell delar upp, förvärvar dess avkomma hälften av antalet karboxifluoresceinmärkta molekyler 6 . Den motsvarande minskningen av cellfluorescens med flödescytometri kan användas för att bedöma celldelning, övervakning av kapaciteten hos undertryckande makrofager för modulering av T-cellimmunresponser. Eftersom CFSE är en fluoresceinbaserad färgämne är den kompatibel med en brOad-intervallet av andra fluorkromer, vilket gör den tillämplig på flervalsflödescytometri. Det lämpliga valet av fluorokrom för fenotypning är också viktigt för att undvika överdriven spektralöverlappning och oförmågan att känna igen antikropps-positiva celler, särskilt med synliga proteinfärger såsom CFSE 7 .
Det finns många fördelar med att använda fluorescerande färgämnen över alternativa tekniker som mäter cellproliferation, såsom tymidininkorporationsanalysen, som använder radiomärkt tymidin (TdR) 8 . Denna analys utnyttjar tritierad tymidin (3H-TdR) som införlivas i nya strängar av kromosomalt DNA under mitotisk celldelning. Ett säkerhetsproblem i samband med denna analys är användningen av radioisotoper, eftersom en scintillations beta-räknare används för att mäta radioaktiviteten i DNA som återvinns från cellerna för att bestämma graden av celldelning. Metodiskt är den tritierade tymidin-rövenAy är inte tillräckligt flexibel för att passa viktiga kliniska laboratoriebegränsningar såsom lågt antal celler och fördröjd analys efter färgning. Tvärtom har CFSE-färgning visat sig förhindra cellproliferation och att störa kritiska aktiveringsmarkörer, såsom CD69, HLA-DR och CD25 9 . Därför är det viktigt att förstå fördelar och begränsningar för varje metod, särskilt i flerfärgade studier där flera färgämnen används för att spåra olika celltyper, för att få exakta och reproducerbara resultat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver de metoder som vi använde för immunokarakterisering av graftinfiltrerande myeloidcellsubset i en experimentell murinmodell av hjärttransplantation, vilken också är tillämplig på andra vävnader i olika murint experimentella modeller. Lågtryckscellsortering vid 20 psi var den föredragna metoden för att isolera ett bra utbyte av rencellsundergrupper. Att upprätthålla renheten hos varje myeloid delmängd är kritisk för att fastställa avgörande resultat av den undertryckande kapacit…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar de tekniska bidrag från flödescytometri, mikrokirurgi och biologiska / patologiska centra av forskningsexpertis på Mount Sinai. Detta arbete stöddes av COST Action BM1305: Åtgärder för att fokusera och accelerera celltolerogen terapi (FACTT), utvecklingsfonderna Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R och SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referencias
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
