Funksjonell karakterisering av regulatoriske makrofager som hemmer graft-reaktiv immunitet
Summary
Makrofager er plastceller av det hematopoietiske systemet som har en avgjørende rolle i beskyttende immunitet og homeostase. I denne rapporten beskriver vi optimaliserte in vitro teknikker for fenotypisk og funksjonell karakterisering av graft-infiltrerende regulatoriske makrofager som akkumuleres i det transplanterte organ under tolerogene forhold.
Abstract
Makrofagakkumulering i transplanterte organer har lenge blitt anerkjent som en funksjon av allograftavvisning 1 . Immunogene monocytter infiltrerer allograftet tidlig etter transplantasjonen, monterer en graftreaktiv respons mot det transplanterte organet, og initierer organavstødning 2 . Nylige data tyder på at undertrykkende makrofager letter vellykket langsiktig transplantasjon 3 og er nødvendig for induksjon av transplantasjonstoleranse 4 . Dette antyder et flerdimensjonalt konsept av makrofage ontogeni, aktivering og funksjon, som krever en ny veikart for isolering og analyse av makrofagfunksjon 5 . På grunn av makrofagens plastisitet er det nødvendig å gi en metode for å isolere og karakterisere makrofager, avhengig av vevsmiljøet, og å definere deres funksjoner i henhold til forskjellige scenarier. Her beskriver viVære en protokoll for immunkarakterisering av graft-infiltrerende makrofager og metodene vi brukte til funksjonelt å evaluere deres evne til å hemme CD8 + T-proliferasjon og for å fremme CD4 + Foxp3 + Treg ekspansjon in vitro .
Introduction
Denne protokollen beskriver in vitro teknikker for å studere funksjonen av vev-infiltrerende makrofager isolert fra hjerteallografer, i henhold til deres evne til å modulere T-celle responser. Bredt beskrevet i litteraturen er fluorescerende cellesporingsfarger i kombinasjon med flytcytometri kraftige verktøy for å studere den undertrykkende funksjonen til spesifikke celletyper in vitro og in vivo. Vår protokoll følger karboxyfluoresceinsuccinimidylester-metoden (CFSE) for overvåkning av lymfocyttproliferasjon in vitro .
Når en CFSE-merket celle deler seg, oppnår avkom halvparten av antall karbokyfluorescein-merkede molekyler 6 . Den tilsvarende reduksjonen i cellefluorescens ved hjelp av flytcytometri kan brukes til å vurdere celledeling, overvåking av kapasiteten til undertrykkende makrofager for å modulere T-celleimmunresponser. Siden CFSE er en fluoresceinbasert fargestoff, er den kompatibel med en brOad rekkevidde av andre fluorokromer, noe som gjør den anvendelig for flervalsfluidcytometri. Det riktige valget av fluorokrom for fenotyping er også viktig for å unngå overdreven spektral overlapping og manglende evne til å gjenkjenne antistoff-positive celler, spesielt med synlige proteinfarger som CFSE 7 .
Det er mange fordeler ved bruk av fluorescerende fargestoffer over alternative teknikker som måler celleproliferasjon, slik som tymidininkorporasjonsanalysen, som bruker radioaktivt merket tymidin (TdR) 8 . Denne analysen benytter tritiert tymidin ( 3 H-TdR) som er innarbeidet i nye tråder av kromosomalt DNA under mitotisk celledeling. Et sikkerhetsproblem forbundet med denne analysen er bruken av radioisotoper, siden en scintillasjon beta-teller brukes til å måle radioaktiviteten i DNA som gjenvinnes fra cellene for å bestemme omfanget av celledeling. Metodisk er det tritierte tymidin-assAy er ikke fleksibel nok til å passe viktige kliniske laboratoriebegrensninger som lavt antall celler og forsinket analyse etter farging. Tvert imot har CFSE-farging vist seg å forhindre celleproliferasjon og å forstyrre kritiske aktiveringsmarkører, slik som CD69, HLA-DR og CD25 9 . Derfor er forståelse fordeler og begrensninger av hver metode, spesielt i flerfargete studier hvor flere fargestoffer brukes til å spore forskjellige celletyper, avgjørende for å oppnå nøyaktige og reproducerbare resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver metodene vi brukte til immunokarakterisering av graftinfiltrerende myeloidcelle-undergrupper i en eksperimentell murint modell for hjerte-transplantasjon, som også gjelder for andre vev i forskjellige murine eksperimentelle modeller. Lavtrykkscellesortering ved 20 psi var den foretrukne fremgangsmåten for å isolere et godt utbytte av rene celleundergrupper. Opprettholde renheten av hver myeloid delmengde er kritisk for å etablere avgjørende resultater av den undertrykkende kapasiteten me…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner de tekniske bidragene til Flow Cytometry, Microsurgery, og Bio-repository / Patologi Centers of Excellence for forskning på Mount Sinai. Dette arbeidet ble støttet av COST Action BM1305: Tiltak for å fokusere og fremskynde Cell Tolerogenic Therapies (A Fact), Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute utviklingsfond, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R og SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referencias
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
