Caratterizzazione funzionale dei macrofagi regolatori che inibiscono l'immunità reattiva dell'inferta
Summary
I macrofagi sono cellule plastiche del sistema ematopoietico che hanno un ruolo fondamentale nell'immunità protettiva e nell'omeostasi. In questa relazione, descriviamo tecniche ottimizzate in vitro per caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente macrofagi regolatori infiltranti che si accumulano nell'organo trapiantato in condizioni tolerogene.
Abstract
L'accumulo di macrofagi negli organi trapiantati è da tempo riconosciuto come una caratteristica del rifiuto di allograft 1 . I monociti immunogenici infiltrano l'allograft presto dopo il trapianto, montano una risposta reattiva dell'innesto contro l'organo trapiantato e iniziano il rigetto dell'organo 2 . Recenti dati suggeriscono che i macrofagi soppressivi facilitano il successo del trapianto a lungo termine 3 e sono necessari per l'induzione della tolleranza al trapianto 4 . Ciò suggerisce un concetto multidimensionale di ontogenesi, attivazione e funzione dei macrofagi, che richiede una nuova tabella di marcia per l'isolamento e l'analisi della funzione macrofagi 5 . A causa della plasticità dei macrofagi, è necessario fornire una metodologia per isolare e caratterizzare i macrofagi, a seconda dell'ambiente tissutale, e per definire le loro funzioni secondo diversi scenari. Qui, abbiamo descriEssere un protocollo per la caratterizzazione immunitaria dei macrofagi infiltranti innestati e dei metodi che abbiamo usato per valutare funzionalmente la loro capacità di inibire la proliferazione CD8 + T e promuovere l'espansione di CD4 + Foxp3 + Treg in vitro .
Introduction
Questo protocollo descrive tecniche in vitro per studiare la funzione dei macrofagi infiltranti del tessuto isolati da allograft cardiaci, in base alla loro capacità di modulare le risposte delle cellule T. Ampiamente descritti in letteratura, i coloranti fluorescenti di monitoraggio delle cellule in combinazione con la citometria a flusso sono strumenti potenti per studiare la funzione soppressiva di specifici tipi di cellule in vitro e in vivo. Il nostro protocollo segue il metodo estere carbossfluoresceina succinimidile (CFSE) per il monitoraggio della proliferazione linfocitaria in vitro .
Quando una cellula etichettata con CFSE si divide, la sua progenie acquisisce la metà del numero di molecole taggate con carbossiofluoresceina 6 . La corrispondente diminuzione della fluorescenza cellulare mediante citometria a flusso può essere utilizzata per valutare la divisione cellulare, monitorando la capacità dei macrofagi soppressivi di modulare le risposte immunitarie delle cellule T. Dal momento che CFSE è un colorante a base fluoresceina, è compatibile con un brLa gamma di altri fluorochromi, rendendola applicabile alla citometria a flusso multi-colore. La scelta appropriata dei fluorochromi per la fenotipizzazione è altrettanto importante per evitare sovrapposizioni spettrali eccessive e l'incapacità di riconoscere cellule positive di anticorpi, in particolare con coloranti proteici visibili come CFSE 7 .
Ci sono molti vantaggi dell'uso di coloranti fluorescenti sulle tecniche alternative che misurano la proliferazione cellulare, come il test di incorporazione della timidina, che utilizza la timidina radiotestata (TdR) 8 . Questo saggio utilizza la timidina tritiata ( 3 H-TdR) che è incorporata in nuovi fili di DNA cromosomico durante la divisione cellulare mitotica. Una preoccupazione di sicurezza associata a questo test è l'uso di radioisotopi, in quanto viene utilizzato un beta-contatore di scintillazione per misurare la radioattività del DNA recuperato dalle cellule al fine di determinare l'entità della divisione cellulare. Metodologicamente, il culo timidina tritiatoAy non è abbastanza flessibile per soddisfare importanti vincoli di laboratorio clinico come il numero ridotto di celle e l'analisi ritardata dopo la colorazione. Al contrario, la colorazione CFSE ha dimostrato di prevenire la proliferazione cellulare e di interferire con marcatori di attivazione critici, come CD69, HLA-DR e CD25 9 . Pertanto, la comprensione dei vantaggi e delle limitazioni di ciascuna metodologia, in particolare negli studi multicolori in cui vengono utilizzati diversi coloranti per tenere traccia di tipi diversi di cellule, è fondamentale per ottenere risultati accurati e riproducibili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo usato per immunocharacterizzare le sottostazioni di cellule mieloide infiltrando l'innesto in un modello sperimentale murino del trapianto di cuore, che è applicabile anche ad altri tessuti in diversi modelli sperimentali murini. La selezione di celle a bassa pressione a 20 psi è il metodo preferito per isolare una buona resa di sottogruppi di cellule pura. Il mantenimento della purezza di ogni sottoinsieme mieloide è fondamentale per stabilire risultati concreti de…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo i contributi tecnici dei centri di flusso, della microchirurgia e dei centri di bio-repository / patologia dell'esperienza di ricerca sul Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto dalla COST Action BM1305: Azione per focalizzare e accelerare le terapie tollerogeniche delle cellule (A FACTT), i fondi per lo sviluppo dello Istituto di trapianto di Mount Sinai Recanati / Miller, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R e SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referencias
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