Caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto
Summary
Los macrófagos son células plásticas del sistema hematopoyético que tienen un papel crucial en la inmunidad protectora y la homeostasis. En este informe se describen las técnicas in vitro optimizadas para caracterizar fenotípicamente y funcionalmente los macrófagos reguladores infiltrantes del injerto que se acumulan en el órgano trasplantado bajo condiciones tolerógenas.
Abstract
La acumulación de macrófagos en los órganos trasplantados se ha reconocido desde hace tiempo como una característica del rechazo del aloinjerto 1 . Los monocitos inmunogénicos se infiltran en el aloinjerto precoz después del trasplante, montan una respuesta reactiva al injerto contra el órgano trasplantado e inician el rechazo del órgano 2 . Datos recientes sugieren que los macrófagos supresores facilitar el éxito a largo plazo transplante [ 3] y son necesarios para la inducción de la tolerancia al trasplante [ 4] . Esto sugiere un concepto multidimensional de la ontogenia, activación y función de los macrófagos, lo que exige una nueva hoja de ruta para el aislamiento y el análisis de la función de los macrófagos [ 5] . Debido a la plasticidad de los macrófagos, es necesario proporcionar una metodología para aislar y caracterizar los macrófagos, dependiendo del entorno tisular, y definir sus funciones de acuerdo con diferentes escenarios. Aquí, describimosSer un protocolo para la caracterización inmune de macrófagos infiltrados por injerto y los métodos que utilizamos para evaluar funcionalmente su capacidad para inhibir la proliferación de T CD8 + y para promover la expansión de Treg CD4 + Foxp3 + in vitro .
Introduction
Este protocolo describe técnicas in vitro para estudiar la función de los tejidos infiltrados macrófagos aislados de aloinjertos cardíacos, de acuerdo a su capacidad para modular las respuestas de células T. Ampliamente descritos en la literatura, los colorantes de seguimiento de células fluorescentes en combinación con citometría de flujo, son potentes herramientas para estudiar la función supresora de tipos específicos de células in vitro e in vivo. Nuestro protocolo sigue el método del éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para monitorear la proliferación de linfocitos in vitro .
Cuando una célula marcada con CFSE se divide, su progenie adquiere la mitad del número de moléculas marcadas con carboxifluoresceína [ 6] . La disminución correspondiente en la fluorescencia celular por citometría de flujo puede usarse para evaluar la división celular, monitoreando la capacidad de los macrófagos supresores para modular las respuestas inmunes de las células T. Dado que CFSE es un colorante basado en fluoresceína, es compatible con una brGama de otros fluorocromos, haciéndolo aplicable a la citometría de flujo multicolor. La elección apropiada de fluorocromos para el fenotipado es también importante para evitar la superposición espectral excesiva y la incapacidad para reconocer células positivas para anticuerpos, particularmente con colorantes proteínicos visibles tales como CFSE 7 .
Existen muchas ventajas de usar tintes fluorescentes sobre técnicas alternativas que miden la proliferación celular, tal como el ensayo de incorporación de timidina, que usa timidina radiomarcada (TdR) 8 . Este ensayo utiliza timidina tritiada (3H-TdR) que se incorpora en nuevas cadenas de ADN cromosómico durante la división celular mitótica. Un problema de seguridad asociado con este ensayo es el uso de radioisótopos, puesto que se utiliza un contador beta de centelleo para medir la radiactividad en el ADN recuperado de las células con el fin de determinar el grado de división celular. Metodológicamente, el culo de timidina tritiadaAy no es lo suficientemente flexible como para adaptarse a importantes limitaciones de laboratorio clínico, como un bajo número de células y un análisis tardío después de la tinción. Por el contrario, coloración CFSE se ha demostrado para prevenir la proliferación celular y para interferir con los marcadores de activación crítica, como CD69, HLA-DR y CD25 [ 9] . Por lo tanto, la comprensión de las ventajas y limitaciones de cada metodología, en particular en estudios multicolores en los que se utilizan tintes múltiples para rastrear diferentes tipos de células, es fundamental para obtener resultados precisos y reproducibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe los métodos que utilizamos para inmunocaracterizar los subgrupos de células mieloides infiltrantes al injerto en un modelo murino experimental de trasplante cardíaco, que también es aplicable a otros tejidos en diferentes modelos experimentales murinos. Clasificación de células de baja presión a 20 psi fue el método preferido para aislar un buen rendimiento de los subconjuntos de células puras. Mantener la pureza de cada subconjunto mieloide es crítico para establecer resultados concluy…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos las contribuciones técnicas de los Centros de Investigación de Citometría de Flujo, Microcirugía y Bio-repositorio / Patología de la Excelencia en Investigación en el Monte Sinaí. Este trabajo fue apoyado por la Acción COST BM1305: Acción para Enfocar y Acelerar las Terapias Tolerogénicas Celulares (A FACTT), los fondos de desarrollo del Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovación SAF2013-48834-R y SAF2016-80031-R Jo
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referencias
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