抑制接枝反应性免疫的调节性巨噬细胞的功能表征
Summary
巨噬细胞是造血系统的塑料细胞，在保护性免疫和体内平衡方面起关键作用。在本报告中，我们描述了优化的体外技术，以表型和功能表征在耐受性条件下积累在移植器官中的移植物浸润调节性巨噬细胞。
Abstract
移植器官中的巨噬细胞积累早已被认为是同种异体移植排斥的特征1 。免疫原性单核细胞在移植后早期浸润同种异体移植，对移植的器官发生移植反应性反应，并引发器官排斥反应2 。最近的数据表明，抑制性巨噬细胞有助于成功的长期移植3 ，是诱导移植耐受所需要的4 。这表明巨噬细胞个体发育，激活和功能的多维概念，这需要一个新的路线图来分离和分析巨噬细胞功能5 。由于巨噬细胞的可塑性，有必要根据组织环境提供分离和表征巨噬细胞的方法，并根据不同的情况来定义它们的功能。在这里，我们描述作为移植浸润巨噬细胞免疫表征的方案，以及我们用于功能评估其抑制CD8 + T增殖和促进体外 CD4 + Foxp3 + Treg扩增的能力的方法 。
Introduction
该方案描述体外技术，以研究从心脏同种异体移植物分离的组织浸润巨噬细胞的功能，根据其调节T细胞应答的能力。在文献中广泛描述，荧光细胞跟踪染料与流式细胞术结合，是研究特定细胞类型在体外和体内的抑制功能的有力工具。我们的方案遵循用于监测体外淋巴细胞增殖的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）方法。
当CFSE标记的细胞分裂时，其后代获得羧基荧光素标记分子数量的一半。通过流式细胞术相应的细胞荧光降低可用于评估细胞分裂，监测抑制性巨噬细胞调节T细胞免疫应答的能力。由于CFSE是基于荧光素的染料，因此它与br相容其他荧光染料范围广，适用于多色流式细胞术。用于表型分析的荧光染料的适当选择对于避免过度的光谱重叠以及不能识别抗体阳性细胞，特别是可见蛋白染料如CFSE 7也是重要的 。
使用荧光染料与测量细胞增殖的替代技术（例如使用放射性标记的胸苷（TdR） 8的胸苷掺入测定法）有很多优点。该测定法利用在有丝分裂细胞分裂期间掺入新染色体DNA链中的氚标记的胸苷（ 3 H-TdR）。与该测定相关的安全性问题是放射性同位素的使用，因为使用闪烁β型计数器来测量从细胞中回收的DNA中的放射性，以便确定细胞分裂的程度。在方法上，氚标记的胸苷屁股ay不足以适应重要的临床实验室限制，如细胞数量少，染色后延迟分析。相反，已经显示CFSE染色可以预防细胞增殖并干扰关键活化标记，如CD69，HLA-DR和CD25 9 。因此，了解各种方法的优点和局限性，特别是在使用多种染料跟踪不同细胞类型的多色研究中，对获得准确和可重现的结果至关重要。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方案描述了我们在心脏移植的实验鼠模型中用于免疫表达移植物浸润性骨髓细胞亚群的方法，其也适用于不同鼠实验模型中的其他组织。在20psi下的低压细胞分选是分离纯细胞亚群的良好产量的优选方法。保持每个骨髓亚群的纯度对于确定不同骨髓群体之间的抑制能力的确定结果至关重要。然而，其他方法可用于分离各种白细胞群体，例如商业浓缩试剂盒。不管感兴趣的细胞群体，从移植组织?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们承认西奈山流行细胞计数，显微外科学和生物储存库/病理学研究中心卓越的技术贡献。这项工作得到了COST行动BM1305：重点关注和加速细胞耐受性治疗的行动（FACTT），西奈半导体/米勒移植研究所发展基金，Ministry of de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R和SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referencias
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