Функциональная характеристика регуляторных макрофагов, которые ингибируют трансплантат-реактивную иммунитет
Summary
Макрофаги представляют собой пластиковые клетки гемопоэтической системы, которые играют решающую роль в защитном иммунитете и гомеостазе. В этом отчете мы описываем оптимизированные методы in vitro для фенотипической и функциональной характеристики трансплантируемых регуляторных макрофагов, которые накапливаются в трансплантированном органе в условиях толерогенности.
Abstract
Накопление макрофагов в трансплантированных органах уже давно признано признаком отторжения аллотрансплантата 1 . Иммуногенные моноциты проникают в аллотрансплантат рано после трансплантации, устанавливают реактивный ответ трансплантата против трансплантированного органа и инициируют отторжение органа. Недавние данные свидетельствуют о том, что подавляющие макрофаги облегчают успешную долгосрочную трансплантацию 3 и необходимы для индукции толерантности к трансплантации 4 . Это предполагает многомерную концепцию онтогенеза, активации и функции макрофагов, которая требует новой дорожной карты для изоляции и анализа функции макрофагов 5 . Из-за пластичности макрофагов необходимо предоставить методологию для выделения и характеристики макрофагов в зависимости от тканевой среды и определения их функций в соответствии с различными сценариями. Здесь мы descriБыть протоколом для иммунной характеристики привитых трансплантатом макрофагов и методов, которые мы использовали для функциональной оценки их способности ингибировать пролиферацию CD8 + T и стимулировать экспрессию CD4 + Foxp3 + Treg in vitro .
Introduction
В этом протоколе описаны методы in vitro для изучения функции тканепроникающих макрофагов, выделенных из аллотрансплантатов сердца, в соответствии с их способностью модулировать ответы Т-клеток. Широко описанные в литературе флуоресцентные клеточные следящие красители в сочетании с проточной цитометрией являются мощными инструментами для изучения супрессивной функции конкретных типов клеток in vitro и in vivo. Наш протокол следует методу карбоксифлуоресцеина сукцинимидина (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов in vitro .
Когда клетка с мечеными CFSE делит, ее потомство получает половину числа молекул, меченных карбоксифлуоресцеином 6 . Соответствующее снижение клеточной флуоресценции проточной цитометрией может быть использовано для оценки деления клеток, контроля способности супрессивных макрофагов модулировать Т-клеточные иммунные ответы. Поскольку CFSE представляет собой краситель на основе флуоресцеина, он совместим с brOad ряда других флуорохромов, что делает его применимым к многоцветной проточной цитометрии. Соответствующий выбор флуорохромов для фенотипирования также важен, чтобы избежать чрезмерного спектрального перекрытия и невозможности распознавания антителоположительных клеток, особенно с видимыми белковыми красителями, такими как CFSE 7 .
Существует много преимуществ использования флуоресцентных красителей в отношении альтернативных методов, которые измеряют пролиферацию клеток, таких как анализ включения тимидина, который использует радиоактивно меченный тимидин (TdR) 8 . В этом анализе используют тритированный тимидин ( 3 H-TdR), который вводится в новые нити хромосомной ДНК во время деления митотических клеток. Проблема безопасности, связанная с этим анализом, заключается в использовании радиоизотопов, поскольку сцинтилляционный бета-счетчик используется для измерения радиоактивности ДНК, выделенной из клеток, для определения степени деления клеток. Методологически, тритированная тимидиновая задницаAy не является достаточно гибким, чтобы соответствовать важным клиническим лабораторным ограничениям, таким как небольшое количество клеток и отложенный анализ после окрашивания. Было показано, что окрашивание CFSE предотвращает пролиферацию клеток и вмешивается в критические маркеры активации, такие как CD69, HLA-DR и CD259. Поэтому понимание преимуществ и ограничений каждой методологии, особенно в многоцветных исследованиях, где несколько красителей используются для отслеживания различных типов клеток, имеет решающее значение для получения точных и воспроизводимых результатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает методы, которые мы использовали для иммуноанализа трансплантат-проникающих миелоидных подмножеств на экспериментальной мышиной модели трансплантации сердца, которая также применима к другим тканям в разных экспериментальных моделях мыши. Сортировка ячейки …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы подтверждаем технический вклад проточной цитометрии, микрохирургии и биорезисторных / патологических центров исследовательского мастерства на горе Синай. Эта работа была поддержана COST Action BM1305: действия по фокусировке и ускорению клеточных толерогенных терапий (ФАКТТ), развивающие фонды Института трансплантации горы Синай Реканати / Миллер, министерство здравоохранения и инноваций SAF2013-48834-R и SAF2016-80031-R ДЖО
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referencias
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
