真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

サークルのSeq法、3 S.を検証するために、細胞は、10代のためのYPDで別々に成長させた後、1×10 10細胞のセレビシエ CEN.PK集団をスクリーニングしました。以前に20（データは示していない）に記載のような染色体の線状DNA除去は、定量PCR ACT1信号が存在しないことによって確認されました。精製され、濃縮されたeccDNAが68百万まで配列決定された読み取り（141-ヌクレオチドシングルエンドの読み取り）とCEN.PK113-7D参照ゲノム（バージョン2012年6月19日）にマッピングされました。 C1、C2およびC4という3つのサンプルから推定されるeccDNAsの記録は、読み取る長い1キロバイト以上の連続によってマッピングされたゲノム領域に割り当てられていました。万モンテカルロシミュレーションに基づいて、隣接することによってマップされた各領域の重要性を1 Kバイト推定されたより長い読み取り。この79、159と56の領域は、おそらくeccDNA系列た（p <0.1、 データセット1）と注釈されたから。記録contiguo数米国> 1のキロバイトサンプルはさらに、（ 図2）が配列決定された場合、より一層eccDNA要素が記録されたであろうことを示唆している配列の深さの関数として増加読み出します。予想されたように、サークルのSeq法は、多数の抽出2μプラスミドを含む公知の環状DNA要素の数、ミトコンドリアDNA、染色体XII上のリボソームRNA遺伝子、およびサンプルにスパイクした3つの内部対照プラスミドのpBR322、pUC19のとpUG72からの読み込みちょうどカラム精製（ 図3）の前に。 ビデオは、染色体IVにHXT7 _ARS432_ HXT6座にマッピングされていることを読み取るの連続の一例を示しています。以前は、[HXT6 / 7 円は ] 10 S288C集団（1×10で各10個の細胞）にサークルのSeqによって検出され、環状DNA構造が逆PCR分析20によって確認されました。 [HXT6 / 7 CIrcle]も3 CEN.PK集団（ 図4A）のそれぞれに記録されました。また、CEN.PKの複製試料間で共通eccDNA遺伝子のほとんどは、S288Cデータセット（ 図4B）からeccDNA遺伝子を重複していました。 環状DNA精製、30μgのゲノムDNAを有する2つのサンプル毎にサークルのSeqプロトコルの特異性を試験するために、試験されました。一つのサンプルは、サークル、配列番号プロトコールにより精製した両方の試料からの100ngのプラスミドDNAおよびeccDNAを補充しました。カラム分離した後、DNAの収量は、プラスミド（GD + P）とサンプル用プラスミドなしの試料について1.27パーセント（380 ngの）（GD）および1.60パーセント（480 NG）でした。エキソヌクレアーゼ処理の効率がACT1に対してPCRを用いて29時間および72時間後の線状DNA含有量について試験した。なしの試料を増幅ACT1（データは示さず）を含んでいませんでした。各エキソヌクレアーゼ処理された試料の画分は、さらにありましたO29によってmplified ポリメラーゼおよび酵素反応の生成物は、ヨウ化プロピジウム染色（ 図5A-F）およびアガロースゲル電気泳動（ 図5G）により分析しました。エキソヌクレアーゼ処理後の試料は、最小限のヨウ化プロピジウム染色（ 図5A-B）を示しました。 O29 -唯一のゲノムDNAで増幅された試料は、対照試料（ 図5E）と同様糸状構造（ 図5C）を明らかにしました。 O29 -追加されたプラスミドを持っていた増幅された試料は、プラスミド対照（ 図5F）に似た病巣（ 図5D）を明らかにしました。画像はO29ポリメラーゼが直鎖状DNA上に環状DNAについて濃縮することを示しました。最も線形染色体DNAは、29時間のエキソヌクレアーゼ処理（ 図5A-B、G）後のサンプルから除去しました。しかし、100以上の時間のために、大規模なエキソヌクレアーゼ処理と、100以上のユニットを使用しましたすべての染色体直鎖DNAを除去するために必要な、O29として-増幅されたサンプルは、依然として72時間のエキソヌクレアーゼ処理（ 図5C-D）後のスレッドのような構造のバックグラウンドを示しました。 サークルのSeq法の図1.概要プロトコルは5段階があります。カラムクロマトグラフィーによる1）細胞培養、2）精製およびeccDNAの濃縮、溶出画分に線形染色体DNAを、残りの3）消化、の4）増幅をO29 DNAポリメラーゼによるDNA、および5）高濃縮eccDNAのシーケンシングおよびSに読み込むのマッピングセレビシエ参照ゲノム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/> 図2.連続シーケンスの深さの関数として> 1キロバイトを読み取る。1×10 10個の細胞からEccDNAは（読み取り、マッピングされた数百万で）シーケンスの深さの関数として増加します。示す：半数体CEN.PK Sからの生物学的三重10 10の細胞分裂によって分離・セレビシエ集団 （C1、C2、C4）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 CEN.PK生物学におけるプラスミドのパーセントで図知られている環状DNA要素の3検出。リード・カバレッジの（AB）散布図は、（密度を読んで）、C1、C2およびC4を複製します。したマップされた（A）は 、内因性酵母プラスミドに読み取ります2μを。 [rDNAのサークル]（染色体XIIからのリボソームRNA遺伝子）;そして、のmtDNA（ミトコンドリアDNA）。 （B）ユニークなプラスミドを制御するためにマッピングされた読み取ります。対照プラスミドは、カラム精製の前にサンプルに添加しました。セル当たりのプラスミド比は次のとおりだった：のpBR322（プラス記号）1：1、pUC19の（円）1時50分、およびpUG72（三角形）1：2500。 CEN.PKとS288C図4.一般的なeccDNA要素。（A）ベン図476の間での重複を表示します 3 CEN.PKサンプル（C1、C2、C4）で294 eccDNA要素上の遺伝子。 16共通の重複eccDNA遺伝子/プラスミドは（すべての遺伝子名は、 データセット1である）注釈が付けられています。 （B）10 S288Cサンプルから推定eccDNAs上のすべての記録された遺伝子と比較して3 CEN.PKサンプル（C1、C2、C4）から推定eccDNAs上のすべての記録された遺伝子のベン図、：S1-S2、R1-R4、Z1-Z4は（参照20を参照します）。遺伝子/プラスミドおよび2株の背景や3またはそれ以上の実験装置の最小値をオーバーラップし、推定eccDNA領域を有する13の生物学的複製（S1-S2、R1-R4、Z1-Z4、C1-C3）が示されています。 Cサンプル、CEN.PK。 RおよびZサンプル、S288C BY4741。 Sサンプル、S288C M3750。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図エキソヌクレアーゼ後のDNAサンプルの5可視化と O 2 9治療。DNAの（AF）ヨウ化プロピジウム染色。スケールバーは10μm。 （A、C及びE）のゲノムDNAを有する試料（GD）。 （BとD）GDプラスプラスミド（GD + P）とサンプル。 （ <strオング> AB）29時間のエキソヌクレアーゼ処理（EXO 29時間）した後、 O29ポリメラーゼ増幅（EXO 72時間+ O29）に続いて72時間のエキソヌクレアーゼ処理後（CD）。 （E）E後のゲノムDNAコントロール：O29ポリメラーゼ増幅; （F）プラスミド対照（5.5キロバイト）後 29ポリメラーゼ増幅; （Gφ）アガロースゲル泳動。左から：L、1キロ​​バイトのマーカー; P、EXO 29時間後のプラスミド対照（5.5キロバイト）。 GD、EXO 29時間後（Aのようにサンプル）。 GD + P、EXO 29時間後（Bなどのサンプル）。 GDおよびGD + P、EXO後29時間+ O29。 GDおよびGD + P、EXO後72時間+ O29（CDのようなサンプル）。表S1を参照してください。 余分な詳細については。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ASET 1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/> CEN.PK.でデータセット1.潜在的なDNAの環状領域 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。 示されたシーケンスデータであり、348の領域について分析します。列は、AD、eccDNAマッピングされています。推定上eccDNAが同定された、サンプル（左から最初のカラム）。 B、​​染色体。 CD、開始および推定eccDNAsの座標を終了します。 EH、eccDNAコンテンツ。 E、自律的領域（ARS）配列を複製。 F、地域の完全な遺伝子; G、領域に含まれる遺伝子の一部。 H、BLASTN-同定された遺伝子。 IO、EccDNAカバレッジとp値。私は、BPで一意に注釈付きの配列と最長の領域と、 J、すべての数は、読み込みマッピングされました。 Kは、すべてのマップされたのカバレッジは、マッピングされた百万読み出す（FPKM）からキロバイトあたりの断片によって読み取ります。モンテカルロシミュレーションから偶然発生に比べ、推定eccDNA用L、p値; M、国連の数iquely読み込み、マッピングされました。 NO; KおよびLのみが一意にマッピングされた使用など（UFPKM）を読み出します。読み取りおよび20は説明したように、モンテカルロシミュレーションであったのマッピングのためのパラメータ。