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Biología

Genomweite Reinigung von extrachromosomale zirkuläre DNA aus eukaryotischen Zellen

Published: April 04, 2016
doi:
10.3791/54239
, , , , ,
1Department of Biology,University of Copenhagen, 2National Veterinary Institute,Technical University of Denmark, 3Group Health Research Institute, 4Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics,Princeton University, 5Calico Life Sciences LLC

Summary

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Abstract

Extrachromosomale zirkuläre DNAs (eccDNAs) sind gemeinsame genetische Elemente in Saccharomyces cerevisiae und in anderen Eukaryoten als auch berichtet. EccDNAs beitragen unter somatischen Zellen in mehrzelligen Organismen zu genetischen Variation und Entwicklung von einzelligen Eukaryoten. Sensitive Methoden für eccDNA Nachweis nötig sind, um zu klären, wie diese Elemente Genomstabilität beeinflussen und wie ökologische und biologische Faktoren, die ihre Ausbildung in eukaryotischen Zellen zu induzieren. Dieses Video stellt eine empfindliche eccDNA-Reinigungsverfahren genannt Kreis-Seq. Das Verfahren umfasst eine Säulenreinigung von zirkuläre DNA, die Entfernung der verbleibenden linearen chromosomalen DNA, Rolling-Circle-Amplifikation von eccDNA, tiefe Sequenzierung und Kartierung. Umfangreiche Exonucleasebehandlung wurde für eine ausreichende lineare chromosomale DNA-Abbau erforderlich. Der Rollkreis Amplifikationsschritt durchine-height:. normal; "> φ 29 – Polymerase für zirkuläre DNA über lineare DNA angereichert Validierung des Kreis-Seq – Methode auf drei S. cerevisiae CEN.PK Populationen von 10 10 Zellen nachgewiesen Hunderte von eccDNA Profile in Größen , die größer als 1 Kilobasen- . Wiederholte Funde von ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 Gene auf zirkuläre DNA in beiden S288c und CEN.PK legt nahe , dass DNA circularization zwischen den Stämmen an diesen Loci. in der Summe der Circle-Seq – Methode verfügt über eine breite konserviert Anwendbarkeit für genomweite Screening für eccDNA in Eukaryonten sowie für bestimmte eccDNA Typen zu erfassen.

Introduction

früh oder transiente chromosomale Amplifikation Erkennen ist schwierig, weil es Veränderungen in einzelnen DNA-Identifizierung von Molekülen, in großen Populationen von Zellen erfordert. Chromosomale copy-number Variationen (CNVs) sind im Allgemeinen gut nach ihrer Einrichtung erkannt, nur die endgültige CNV Struktur als Beweis für den Mechanismus zu verlassen, die die Variation 1,2 erzeugt. Das Erkennen und extrachromosomale zirkuläre DNA (eccDNA) in früheren Stadien der CNV Bildung erholt könnte laufenden Prozesse in der genomischen Umlagerungen aufzuklären.

Zuvor de novo Entdeckung eccDNA wurde durch elektronenmikroskopische Aufnahmen 3, Giemsa – Färbung von Chromosomen in der Metaphase 4 oder zweidimensionalen Gelelektrophorese 5. Diese Methoden bieten wenig oder keine Information über die Sequenz der zirkulären DNA. Gezielte Techniken wie Southern Blotting 6,7, inverse PCR 8 oder Fluoreszenz – de – situ hybridization 9 belegen nur über bestimmte eccDNA Elemente. Keines dieser Verfahren liefern die Abfolge aller vorhandenen eccDNA Typen in einer Zellpopulation.

Genomische Divergenz in einem Pool von Zellen kann durch Genom – Sequenzierung und / oder Tiling Arrays 10,11 charakterisiert werden. Eine Deletion oder Verstärkung durch herkömmliche DNA – Reinigungsverfahren Nachweis erfordert in der Regel , dass ein mutiertes Allel mindestens 0,1-1% der Zellpopulation repräsentieren 12,13. Azentrische eccDNAs erwartet noch mehr transient in einer Zellkultur zu sein, wegen ihres Mangels an Romeren und potentielle Abwesenheit der DNA-Synthese bei der Replikation. Da somit vermutlich die meisten eccDNAs in geringen Mengen sind und deren Sequenzen ähneln dem Genom werden alternative DNA-Extraktionsverfahren benötigt eccDNAs zu erkennen.

Mehrere zirkuläre DNA-Reinigungstechniken nutzen die strukturellen Unterschiede zwischen den Chromosomen und zirkuläre DNA. Beispielsweise Hochgeschwindigkeits ultracentrifugation in Cäsiumchlorid – Gradienten verwendet 350-3000 Basenpaare (bp) große eccDNAs aus dem menschlichen HeLa – Krebszelllinie 14 zu isolieren. Allerdings kann mit hoher Geschwindigkeit brechen oder nick das Rückgrat der supercoiled zirkuläre DNA – Strukturen, die Änderung der Sedimentationsgeschwindigkeit 15 und die eccDNA Ausbeute. Dutta und Mitarbeiter entwickelten ein Verfahren zur de novo, genomweite Identifikation von zirkulären DNA aus Mausgeweben sowie aus Kulturen von Hühner- und menschlichen Zellen 16,17. Ihre Methode ist die Extraktion von Keimen aus homogenisierten Gewebe durch Saccharose-Ultrazentrifugation, gefolgt von Plasmidaufreinigung und mehrere Runden von enzymatischen Reaktionen und DNA-Extraktionen. Ihr Protokoll identifiziert in erster Linie 200-400 bp eccDNAs, genannt microDNAs. Dutta und Mitarbeiter auch Reinigung von microDNAs aus Saccharomyces cerevisiae versucht , aber konnte nicht microDNA aus dieser Hefearten 16 aufzunehmen.

Wir haben ein neues Verfahren entwickelt fürde novo Nachweis von eccDNA aus Hefe genannt Kreis-Seq. Dieses Verfahren ermöglicht die genomweite Erhebungen für zirkuläre DNA-Moleküle groß genug ganze Gene und so groß wie das 86 Kilobasen (kb) mitochondriale DNA (mtDNA) zu tragen. Der Kreis-Seq – Methode wurde aus einem gut etablierten prokaryontischen Plasmid Reinigungsverfahren 18,19, optimiert für eukaryotische Hefezellen und kombiniert mit tiefen Sequenzierung entwickelt. Mit dem Kreis-Seq Ansatz 1756 verschiedene eccDNAs, die alle größer als 1 kb wurden aus zehn S. entdeckt cerevisiae S288c Populationen 20. Eine Größe cut-off wurde auf eccDNA konzentrieren ausgewählt, die ganze Gene tragen groß genug waren. Kreis-Seq war sehr empfindlich; detektiert einen einzigen eccDNA innerhalb Tausende von Zellen 20. In der aktuellen Studie wurde Kreis-Seq zu isolieren und zu identifizieren 294 eccDNAs von drei biologischen Replikate von anderen S. verwendet cerevisiae Hefestamm, CEN.PK. Die Daten zeigen, dass eccDNA eine gemeinsame genetische eleme istnt in S. cerevisiae – Stämme.

Protocol

HINWEIS: Ein Überblick über die zirkuläre DNA Reinigung und Sequenzierungsverfahren (Kreis-Seq) ist in Abbildung 1 veranschaulicht. 1. Anbau, Zellernte und Plasmamembran Disruption Impfen Hefezellen (zB Saccharomyces cerevisiae) aus einer O / N – Kultur in 50 ml komplettes Nährmedium von Hefe – Pepton Dextrose (YPD). Beimpfen mit einer niedrigen Anfangszelldichte von 1-3 x 10 5 Zellen / ml oder eine optische Dichte von ungefähr 0,01 OD 600. Inkubieren der Zellen bei 30 ° C unter Rühren bei 150 Umdrehungen pro Minute (rpm) , bis die Zellen maximale Zelldichte von etwa 1 x 10 10 Zellen zu erreichen, etwa nach 24 bis 48 Stunden oder einer optischen Dichte bei OD 600> 10,0. HINWEIS: Die Kultivierungszeit nicht entscheidend ist, da niedrigere Zellkonzentrationen verwendet werden können. Übertragen die outgrown Kultur in ein 50 ml konisches Röhrchen, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei800 g für 3 min und den Überstand verwerfen. Waschen des Pellets mit 25 ml Pufferlösung von 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, erneut pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 800 × g für 3 min, und der Überstand verworfen. Resuspendieren des Zellpellets in 1,2 ml Resuspensionspuffer aus einem Plasmid column-Purification Kit geliefert. Optionaler Schritt: In stark verdünnten Plasmide als Kontrollen für die Reinigung von zirkuläre DNA – Elemente 20. HINWEIS: In der aktuellen Datensatz ein 7,7 & mgr; l Plasmid – Mischung für jede Probe aufgetragen wurde 10 10 Zellen enthält. Das Plasmid Lager Mischung bestand aus drei Plasmiden in unterschiedlichen Konzentrationen; pBR322 bei 38 ng / Probe, pUC19 bei 0,5 ng / Probe und pUG72 bei 0,01 ng / Probe. 3-Verhältnis der gesamten Suspension Volumen: Übertragen Sie die Zellsuspension in zwei 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils mit einem 1 mit 0,5 mm Glasperlen ergänzt. Vortex jedes Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min Plasmazelle zu stören,Membranen. Pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 268 × g für 30 Sekunden und übertragen Sie die 1,2 ml kombinierte Überstand von den zwei Mikrozentrifugenröhrchen in ein neues Röhrchen. HINWEIS: Alternativ 1,6-1,7 zu ​​Schritt verwenden Zymolyase Zellen in 0,6 ml Resuspensionspuffers Lösung zu stören. Zehn Einheiten von Zymolyase können stören 5 x 10 7 Zellen innerhalb von 1,5 h bei 35 ° C. 2. EccDNA Anreicherung durch Säulenchromatographie Folgen Sie dem Protokoll aus einem Bausatz für Säulenreinigung von Plasmiden. Kurz gesagt, behandeln jede Probe mit 1,2 ml alkalische Lösung, vorsichtig mischen und Inkubation 3 min bei RT. In 1,2 ml Neutralisationspuffer, vorsichtig mischen und Zentrifuge bei 9650 xg für 5 min. Laden der Lösung auf eine Säule, äquilibriert mit 1 ml Äquilibrierungslösung und die Flüssigkeit durch die Kolonne durch Schwerkraft zu fließen. Die Säule wird mit 4 ml Waschlösung. Wenn die Lösung durch das Harz geleitet wurde, fügt vorsichtig 0,3 ml der Elution sosung die meisten der 0,35 ml Säulenhohlraumvolumen zu ersetzen. Eluieren der DNA in eine neue Sammelröhrchen mit 1 ml Elutionslösung und fällt die DNA um 0,8 ml Präzipitationsgemischs Zugabe. Zentrifuge bei 9650 × g für 10 min. Waschen des DNA-Pellets mit 0,5 ml 70% Ethanol, Zentrifuge bei 9650 xg für 5 min lufttrocknen für 5 bis 15 min und lösen die gereinigte DNA in 25 ul sterilem Wasser. HINWEIS: Nur kurzzeitige Lagerung von DNA in Wasser wird empfohlen. Vorzugsweise gehen Sie direkt zu Schritt 3. 3. Die Verdauung von Rest Linear chromosomale DNA Fakultativer Schritt: Zu spezifischen Verdau von linearen DNA durch Exonuklease zu erleichtern, um die gereinigte DNA mit einer seltenen Schneid Endonuklease wie NotI behandeln. Für 5 ug DNA, verwenden Sie 1 Einheit NotI, 5 ul 10x Verdauungspuffer und sterilem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ul. Inkubiere die Reaktion bei 37 ° C für 16 Stunden und Hitze inaktiviert die Endonuklease bei 80 ° C für 5 min. In 20Einheiten Exonuclease (2 & mgr; l), 4 ul ATP (25 mM), 34 ul steriles Wasser und 10 ul 10x Reaktionspuffer direkt mit dem 50 & mgr; l-Endonuclease gespaltenen DNA eine 1x Reaktionsvolumen von 100 & mgr; l zu erreichen, die ATP-abhängige Exonuklease Verwendung Kit. Führen Hydrolyse von linearen einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA bei 37 ° C für 5 Tage oder mehr. Fügen Sie einen zusätzlichen 4 ul ATP (25 mM), 0,6 ul 10x Reaktionspuffer und 20 Einheiten alle 24 h Exonuklease die enzymatische DNA-Verdauung bei einem 1x Reaktionsvolumen fortzusetzen. Nach dem Entfernen der linearen DNA, Probe 2 & mgr; l aus der behandelten Lösung Exonuklease 20 Eliminierung der chromosomalen DNA linear durch quantitative Polymerase – Kettenreaktion (qPCR) unter Verwendung einer chromosomalen Marker , wie beispielsweise das Actin – Gen ACT1 zu bestätigen. Jede 20 ul qPCR Reaktionsvolumen enthält 2 ul Exonuclease-behandelten Probe, 150 nM ACT1 Primer 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 'und 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (Volumen / Volumen) Dimethylsulfoxid und 10 & mgr; l grün fluoreszierende Master-Mix. Verwenden Sie die Reaktionsbedingungen; 3 min bei 95 ° C, von 45 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C und 30 sec bei 60 ° C gefolgt. HINWEIS: ACT1 ist ein besonders geeigneter Marker für die lineare DNA seit Kopienzahl Variationen in diesem Gen schädlich sind 21-23 so eccDNA sollte nicht ACT1 tragen. Alternativen zur Analyse von DNA-Verdau durch qPCR sind Standard-PCR (4.3) oder Propidiumiodid-Färbung (4.4). Verwenden 2 ul Exonuclease-behandelte Probe als PCR – Matrize mit ACT1 Primern 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'und 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. Als positive ACT1 Steuerung verwenden 50-100 ng genomischer S. cerevisiae – DNA als Matrize. PCR-Reaktionsbedingungen; 3 min bei 95 ° C, gefolgt von 35 Zyklen von 30 sec bei 95 ° C, 30 sec bei 56 ° C und 1 min bei 72 ° C. Run-PCR-Reaktionen durch Gel electrophoresis auf 1% Agarose mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid. Suchen Sie nach einer 0,8 kb ACT1 Band. Die Abwesenheit oder Anwesenheit von linearer DNA kann auch vor und nach der DNA-Amplifikation durch Propidiumiodid-Färbung untersucht werden. Mischen Sie jede DNA – Probe in einem 1: 1 Volumen mit einer 1: 1000 H 2 O-verdünnte Lösung von 20 mM Propidiumiodid Lager. Verlassen Lösung im Dunkeln für 10-20 min bei RT und DNA-Färbung analysiert mittels Fluoreszenzmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung einen roten Fluoreszenzanregungsfilter bei 663 bis 738 nm verwendet und eine Belichtungszeit von 5 bis 30 sec. Als DNA-Färbung Kontrolle-amplifizierte ø29 Verwendung genomischer DNA aus Hefe und / oder ø29-amplifizierte Plasmid. Wärme inaktivieren die Exonuclease-Lösung bei 70 ° C für 30 min. 4. DNA Amplification Amplify das gereinigte und angereichert eccDNA aus Schritt 3.5) mit ø29 DNA – Polymerase 24-26 according dem Protokoll der Polymerase-Hersteller. Kurz gesagt, mischen 5 ul angereichert eccDNA mit 5 ul Denaturierungspuffer. Nach 3 min bei RT, mit 10 & mgr; l Neutralisationspuffer. Vorsichtig mischen und fügen Sie 30 ul Master-Mix enthält 29 & mgr; l Reaktionspuffer und 1 ul ø29 DNA-Polymerase. Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 16 Stunden oder mehr (bis zu 72 h). Wärme inaktivieren die ø29 DNA-Polymerase bei 65 ° C für 3 min. 5. Sequenzierung und Datenanalyse Scher das verstärkte eccDNA mit einem fokussierten Ultraschallgerät auf eine durchschnittliche Soll-Spitzengröße von 300 bp. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für eine 130 & mgr; l DNA-Probe: 450W Spitzenintensität Leistung, 60 sec Behandlung, 30% Tastverhältnis, 200 Zyklen pro Burst, Temperatur 7 ° C. Fügen Sie Barcode-Etiketten und Index-Adapter die fragmentierte für die Synthese von Bibliotheken für die Sequenzierung liest, eine geeignete Methode zur Bibliothek Vorbereitung. Führen tiefe Sequenzierung, zum Beispiel als 141-Nukleotid-Single-End auf einem Hochdurchsatz-Sequenzierung Plattform liest. Karte liest, um die Hefe Referenzgenom untersuchten und erlauben liest, um mehrere Regionen abzubilden. Verwenden Sie zum Beispiel eine frei verfügbare Workflow – System 27,28 und Kurz Lese – Aligner – Mapping – Software 29. Identifizieren liest aus Regionen putative eccDNAs zusammenhängenden Verwendung liest, beispielsweise mehr als sieben zusammenhängenden liest (> 1 kb) , ohne Lücken 20. HINWEIS: Software ist verfügbar 27,28 für die Erkundung in genomischen Regionen von Interesse abgebildet liest.

Representative Results

Zur Validierung der Circle-Seq – Methode, drei S. cerevisiae CEN.PK Populationen von 1 x 10 10 Zellen wurden gescreent , nachdem die Zellen für zehn Generationen in YPD gezüchtet wurden getrennt. Chromosomale DNA linear Eliminierung wurde durch das Fehlen eines qPCR ACT1 Signal bestätigt , wie vorher 20 (Daten nicht gezeigt) beschrieben ist . Gereinigte und angereichert eccDNA wurde auf 68 Millionen liest (141-Nukleotid-Single-End liest) und kartiert auf die CEN.PK113-7D Referenzgenoms (Version 19. Juni 2012) sequenziert werden. Aufnahmen putative eccDNAs aus den drei Proben genannt C1, C2 und C4 wurden genomischen Regionen von zusammenhängenden liest mehr als 1 kb kartiert zugeordnet. Auf der Grundlage von 10.000 Monte Carlo-Simulationen, die Bedeutung jedes von zusammenhängenden Region kartiert liest mehr als 1 kb geschätzt. Aus dieser 79, 159 und 56 Regionen wurden als wahrscheinlich eccDNA Sequenzen (p <0,1, Datensatz 1) kommentiert. Die Anzahl der aufgezeichneten contiguous liest> 1 kb als Funktion der Sequenztiefe erhöht darauf hindeutet , dass noch mehr eccDNA Elemente aufgezeichnet worden wären , wenn Proben hatten weiter sequenziert worden (Figur 2). Wie erwartet, extrahiert die Kreis-Seq Verfahren zahlreiche liest aus einer Anzahl von bekannten kreisförmigen DNA-Elemente, einschließlich der 2μ-Plasmid, mitochondriale DNA, die ribosomale RNA-Gene auf dem Chromosom XII und die drei internen Kontroll Plasmide pBR322, pUC19 und pUG72, die in Proben versetzt wurden kurz vor dem Säulenreinigung (Abbildung 3). Das Video zeigt ein Beispiel von zusammenhängenden, die an die HXT7 _ARS432_ HXT6 Locus auf Chromosom IV abgebildet liest. Zuvor wurde die [HXT6 / 7 circle] detektiert durch Kreis-Seq in zehn S288c Populationen (je 1 x 10 10 Zellen) und die kreisförmige DNA – Struktur wurde durch inverse PCR – Analyse 20 bestätigt. Die [HXT6 / 7 circle] wurde auch in jeder der drei Populationen CEN.PK (4A) aufgezeichnet. Außerdem sind die meisten der gemeinsamen eccDNA Gene unter Wiederholungsproben von CEN.PK überlappt eccDNA Gene aus den S288c Datensätze (4B). Um die Spezifität des Kreis-Seq-Protokoll für zirkuläre DNA Aufreinigung Test wurden zwei Proben, die jeweils mit 30 & mgr; g genomische DNA wurden getestet. Eine Probe wurde mit 100 ng Plasmid-DNA und eccDNA aus beiden Proben wurden ergänzt durch den Kreis-Seq-Protokoll gereinigt. Nach Säulentrennung wurde die DNA-Ausbeute von 1,27% (380 ng) für die Probe ohne Plasmid (GD) und 1,60% (480 ng) für die Probe mit dem Plasmid (GD + P). Die Effizienz der Exonuclease – Behandlung wurde für lineare DNA – Gehalt nach 29 h und 72 h unter Verwendung von PCR gegen ACT1 getestet. Keine Proben enthielten ACT1 amplifiziert (Daten nicht gezeigt). Ein Bruchteil jeder Exonuklease behandelten Probe wurde weiter eindurch die ø29 mplified Polymerase und die Produkte der enzymatischen Reaktionen wurden durch Propidiumiodid – Färbung (5A-F) und Agarose – Gelelektrophorese (5G) analysiert. Die Proben nach Exonucleasebehandlung zeigten minimale Propidiumiodid-Färbung (5A-B). Die ø29 – verstärkte Probe mit nur genomischen DNA ergab , fadenartigen Strukturen (5C) , ähnlich der Kontrollprobe (5E). Die ø29 – verstärkte Probe , die hinzugefügt Plasmid hatte ergeben , Brennpunkte (5D) ähnelt dem Plasmidkontrolle (5F). Die Bilder zeigten, dass ø29 Polymerase für zirkuläre DNA über lineare DNA angereichert. Linearsten chromosomale DNA wurde aus Proben nach 29 h Exonukleasebehandlung (5A-B, G) entfernt. Die Behandlung umfangreiche Exonuklease für mehr als 100 Stunden und unter Verwendung von mehr als 100 Einheiten war benötigt alle chromosomalen lineare DNA zu entfernen, wie Ø29 – amplifizierten Proben immer noch einen Hintergrund von gewindeartigen Strukturen nach 72 h Exonuklease – Behandlung (5C-D) gezeigt. . Figur 1. Darstellung der Kreis-Seq Verfahren Das Protokoll besteht aus 5 Schritten: 1) die Zellkultur, 2) Reinigung und Anreicherung von eccDNA durch Säulenchromatographie, 3) Verdauung der verbleibenden linearen chromosomalen DNA in der Eluatfraktion, 4) Amplifizierung DNA von Ø29 DNA – Polymerase und 5) Sequenzierung von hochangereicherten eccDNA und Kartierung von liest die S. cerevisiae Referenzgenom. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/> Abbildung 2. Contiguous liest> 1 kb als Funktion der Sequenz Tiefe. EccDNA von 1 x 10 10 Zellen als Funktion der Sequenz Tiefe erhöhen (in Millionen abgebildet liest). Dargestellt: biologische Triplikaten von haploiden CEN.PK S. cerevisiae Populationen (C1, C2, C4) durch 10 10 Zellteilungen getrennt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Der Nachweis von bekannten zirkuläre DNA – Elemente. (AB) Streudiagramme von Leseabdeckung (Lesedichte) in Prozent für Plasmide in CEN.PK biologischen repliziert C1, C2 und C4. (A) Mapped liest den endogenen Hefe – Plasmide waren: 2μ; [RDNA Kreis] (Ribosomale RNA-Gene aus dem Chromosom XII); und mtDNA (die mitochondriale DNA). (B) Einzigartige liest abgebildet Plasmide zu steuern. Kontroll Plasmide wurden in Proben vor der Säulenreinigung versetzt. Plasmid-Verhältnisse pro Zelle waren: pBR322 (Pluszeichen) 1: 1, pUC19 (Kreise) 01.50 und pUG72 (Dreiecke) 1: 2.500. Abbildung 4. Gemeinsame eccDNA Elemente in CEN.PK und S288c. (A) Venn – Diagramm Anzeige Überlappung unter den 476 Gene auf 294 eccDNA Elemente in den drei Proben CEN.PK (C1, C2, C4). Die 16 gemeinsame überlappende eccDNA Gene / Plasmide sind kommentiert (alle Gen – Namen sind in Datensatz 1). (B) Venn – Diagramm aller aufgenommenen Gene auf putative eccDNAs aus den drei Proben CEN.PK (C1, C2, C4), im Vergleich zu allen aufgezeichneten Gene auf putative eccDNAs 10 S288c Proben: S1-S2, R1-R4(Siehe Referenz 20), Z1-Z4. Gezeigt werden 13 biologischen Replikaten (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) mit Gene / Plasmide und mutmaßliche eccDNA Regionen, die ein Minimum von 2 Stamm Hintergründe und entweder 3 oder mehr Versuchsaufbauten überlappt. C Proben, CEN.PK; R und Z Proben S288c BY4741; S – Proben, S288c M3750. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5. Visualisierung von DNA – Proben nach Exonuklease und ø 2 9 Behandlung. (AF) Propidiumiodidfärbung von DNA. Maßstabsbalken, 10 & mgr; m. (A, C und E) Proben mit genomischer DNA (GD); (B und D) Proben mit GD und Plasmid (GD + P). ( <str Ong> AB) Nach 29 Stunden Exonucleasebehandlung (EXO 29 h); (CD) nach 72 Behandlungs hr Exonuklease gefolgt von ø29 – Polymerase – Amplifikation (EXO 72 h + ø29). (E) Genomic DNA Kontrolle nach e: ø29 Polymerase Verstärkung; (F) Plasmidkontrolle (5,5 kb) nach 29 Polymerase-Verstärkung; (G ø) Agarose – Gel-Elektrophorese. Von links: L, 1 kb Marker; P, Plasmidkontrolle (5,5 kb) nach EXO 29 h; GD, EXO nach 29 h (Probe wie in A); GD + P, nach EXO 29 h (Probe B); GD und GD + P, nach EXO 29 h + ø29; GD und GD + P, nach EXO 72 h + ø29 (Probe wie in CD). Siehe Tabelle S1 für zusätzliche Details. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. aset 1 "src =" / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/> Datensatz 1. Potential DNA circularization Regionen in CEN.PK. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen. Dargestellt sind Sequenzdaten und Analysen für 348 Regionen. Die Spalten sind AD, eccDNA Mapping. Eine (erste Spalte von links), Probe, von der mutmaßlichen eccDNA identifiziert wurde; B, Chromosom; CD, Beginn und Ende-Koordinaten von vermeintlichen eccDNAs. EH, eccDNA Inhalt. E, autonom Sequenz (ARS) in der Region replizierende; F, vollständige Gen in der Region; G, Teil des Gens in der Region enthalten sind; H, BLASTN-Gen identifiziert. IO, EccDNA Abdeckung und p-Werte. I, längste Region mit einer einzigartig kommentierten Sequenz in bp; J, Anzahl aller abgebildet liest; K, Abdeckung aller pro kb abgebildet liest von einer Million von Fragmenten abgebildet liest (FPKM); L, p-Wert für mutmaßliche eccDNA im Vergleich zum Auftreten durch Zufall von Monte-Carlo-Simulationen; M, die Anzahl der uniquely abgebildet liest; NEIN; wie K und L nur eindeutig abgebildet mit liest (UFPKM). Die Parameter für die Zuordnung der Lese- und Monte – Carlo – Simulationen waren wie 20 beschrieben.

Discussion

Der Kreis-Seq-Methode ermöglicht es genomweite Detektion von eccDNA aus Hefezellen mit Sequenz-Level-Auflösung. Das Verfahren ist eine milde Reinigung eccDNA die nicht intensive Wirbel oder Pipettieren erfordert und verwendet Säulentrennung durch Schwerkraft eccDNA Bruch zu begrenzen, die Exonuclease-Verdau im nachfolgenden Schritt führen würde. Diese Merkmale des Verfahrens kann zur Detektion großer eccDNAs entscheidend sein, die Gensequenzen enthalten. Kreis-Seq zahlreiche eccDNAs einschließlich der vollständigen Gene (Datensatz 1) nachgewiesen. Es erfasst auch die 86-kb Hefe-Mitochondrien-DNA. Somit erleichtert dieses Protokoll Reinigung von großen runden DNA-Elemente. Halten der Anzahl von DNA-Extraktionsschritte auf ein Minimum reduziert das Risiko von eccDNA Verlust und maximiert die Ausbeute. Basierend auf den Ergebnissen für die Steuerung, gespickt-in Plasmiden, Kreis-Seq sehr empfindlich ist, eine einzige kreisförmige DNA aus 2500 Zellen zu erkennen. Weiterhin Entfernen reichlich endogene Plasmide wie 2μ; Plasmid oder Mitochondrien-DNA könnte signifikant Empfindlichkeit erhöhen. Die Aushärtung von 2μ aus Hefekulturen wurde 30 beschrieben. Alternativ könnte 2μ und mitochondriale DNA Entfernung mit einer seltenen Schneid Endonuklease erreicht werden, wie beispielsweise SwaI. Allerdings könnte das Restriktionsenzym Schritt andere eccDNAs von Interesse zielen und die Gesamt eccDNA Ausbeute begrenzen.

Kritische Schritte zur Erkennung eccDNA waren Entfernung von linearer DNA (Schritt 3) und DNA-Sequenzierung (Schritt 5) zu einer geeigneten Tiefe. Um die Mehrheit der eccDNAs aus einer Zellpopulation, tiefe Sequenzierung erfassen könnte 20 erforderlich. Gepaart-End-Sequenzierung sollte noch mehr Vertrauen der eccDNA Nachweis liefern, als zirkuläre DNA-Kreuzungen werden erwartet, gepaart-End zu erhalten liest discordantly diese Karte. Diese Diskrepanzen unterstützen die Entdeckung von kreisförmigen DNA-Strukturen und kann möglicherweise als zusätzliche eccDNA Detektionsfilter verwendet werden.

Der Kreis-Seq Verfahren wurde unter Verwendung von drei unabhängigen S. validiert cerevisiae CEN.PK Populationen. Erkannt Sequenzen enthalten zuvor eccDNAs, endogene Plasmide berichtet und versetzt in Plasmide und Hunderte von mutmaßlichen eccDNAs (Datensatz 1). Diese Ergebnisse stützen frühere Kreis-Seq Datensätze von S. cerevisiae S288c 20. Die Entdeckung von mehreren eccDNAs gemeinsam CEN.PK und S288c Populationen zeigt , dass diese Loci haben eine Neigung als kreisförmige Elemente vorhanden sind (Figur 4). Wir haben früher , dass die [Kreis LÜCKE1] gezeigt 8 unter Stickstoff begrenzten Bedingungen im CEN.PK Hintergrund angereichert ist, obwohl Beweise für [LÜCKE1 Kreis] in anderen Stamm Hintergründe nicht gefunden wurde. Auffindung des eccDNA aus dem CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 und HXT6 HXT7 Loci in beide S288c und CEN.PK legt nahe , dass eine Veranlagung für die DNA – circularization ist conzwischen den Hefestämmen angeboten. Es bleibt zu zeigen , wenn [HXT6 / 7 Kreis], [ASP3-1 Kreis], [COS111 Kreis] und [CUP1-1 RSC30 Kreis] selektive Vorteile Zellen verleihen oder wenn ihre Existenz ist nur ein Effekt der hohen Raten von DNA circularization.

Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass Kreis-Seq zum Erfassen Kilobasen–sized eccDNAs gut geeignet ist, und hat Vorteile für eccDNAs mit vollständigen Genen identifiziert. Kreis-Seq ist ein hochempfindliches Verfahren, das gesamte Genom-Skala Bildschirme von eccDNAs aus Hefe ermöglicht. Der Kreis-Seq Methode könnte ein neues Feld der Forschung an der Aufklärung der Rolle von eccDNA Ziel öffnen in der Gen-Deletionen und Amplifikationen erzeugen. Da die DNA-Architektur und Struktur von eukaryotischen Hefe zu höheren Eukaryonten weitgehend erhalten, die Kreis-Seq-Methode sollte im Prinzip sein applicable zu allen eukaryotischen Zellen, mit leichten Modifikationen. Derzeit ist das Verfahren nicht erscheinen keine Grenzen zu haben, obwohl seine Fähigkeit Megabasen große eccDNAs zu reinigen hat noch gezeigt werden. Darüber hinaus ist die Verwendung von DNA – Polymerase O29, die eine rolling-circle – Verstärkungsverfahren 31 verwendet, erzeugt eine Tendenz zu kleineren eccDNAs Herstellung eccDNA Quantifizierung erschwert. Kreis-Seq erkennt eccDNAs groß genug vollständige Gene zu tragen, so dass es für Studien über Doppel Minuten-zirkuläre DNA aus menschlichen Körperzellen zu machen. Doppel Minuten kann zu Krebs beitragen , wenn Proto-Onkogene auf diesen Elementen 32-37 verstärkt werden. Studien von eccDNAs in konnte Keimbahnzellen verwendet werden, Keimbahnmutation Raten zu messen und die Spermienqualität, zum Beispiel in der Tier beurteilen. Somit hat Kreis-Seq das Potential Einblicke in die Rate zu erhalten, bei der genetischen Variation in der Form Variation der Kopienzahl entsteht, und auf ein neues Verständnis von Krankheiten führen, die Gen kopier beinhaltenZahlvariation 38-40.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.

Materials

Bacto peptone BD Difco 211677 Alternative product can be used.
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix  Agilent Technologies 600882 For qPCR analysis. Alternative product can be used.
Dextrose (D-glucose) Carl Roth HN06.4 Alternative product can be used.
Disruptor Beads, 0.5 mm Scientific Industries, Inc. SI-BG05 Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used.
Ethidium bromide Carl Roth 2218.2 Agarose gel stain for detecting DNA/RNA.
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo Fisher K0502 Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used 
NotI, FastDigest Life Technologies -  Thermo Fisher Scientific, USA FD0594 Endonuclease. Alternative product can be used. 
Plasmid Mini AX kit  A&A Biotechnology, Poland 010-50 Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA.  
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit Epicentre, USA E3105K ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used.
Propidium iodide  Sigma-Aldrich, USA 81845 Alternative product can be used.
pUG6 plasmid EUROSCARF, Germany P30114 Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch
QIAGEN genomic-tip 100/G  Qiagen, USA 13343 Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used.
REPLI-g Mini Kit protocol  Qiagen, USA 150023 Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase 
Yeast extract BD Difco 210929 Alternative product can be used.
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) Nordic BioSite, Sweden Z1004-3 Alternative product can be used.
Data access to sequence files European Nucleotide Archive  EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. 
Strains
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D Genotype MATa MAL2-8c SUC2
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool EUROSCARF, Germany S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX.
Equipments
DNA Spectrophotometer  NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher Measuring DNA concentration. Alternative product can be used.
Fluorescence microscopy Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. Alternative product can be used.
Robotic library-build system Apollo 324, IntegenX Inc. DNA library preparation. Alternative product can be used.
Sequencing platform Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. DNA sequencing. Alternative product can be used.
Ultrasonicator Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes Alternative product can be used.
Methods
2% YPD media  Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave.
Circle-Seq test on genomic DNA Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. 
Mapping software Bowtie2 aligner, John Hopkins University Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.
Propidium iodide stain Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). 
Workflow bioinformatic system Galaxy, Open source. A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5.
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Møller, H. D., Bojsen, R. K., Tachibana, C., Parsons, L., Botstein, D., Regenberg, B. Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (110), e54239, doi:10.3791/54239 (2016).
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