人胎盘及蜕膜器官培养研究在母胎界面感染

实验是根据赫尔辛基宣言中所表达的原则进行。这项研究是经旧金山（CHR＃11-05530）机构审查委员会在加州大学。提供的所有患者写给样品和后续分析收集的知情同意书。组织收集作为去标识标本。 注：研究人员，必须获得其机构人类受试者审查委员会的批准。标本根据妊娠史或胎盘异常排除会根据任何具体研究的需要而有所不同。 注意：适当的安全条件（生物安全2级）应被用于在该协议12的所有步骤。 1.准备，在此之前收集日高压灭菌过滤/收集镊子和微型剪刀解剖/镊子。 准备洗涤液的货量充足（500毫升每个试样）（重FER 表1配方）。 准备充足的量（每片100毫升）中0.22微米的无菌过滤收集媒体（ 见表1配方）。 等分细胞外基质（ECM，参照试剂的表的信息），用于长期存储。 商店的ECM以固体形式在-20℃下。为了获得最佳性能，避免重复冻融。解冻瓶在4℃的粘稠溶液，并在冷室用冷却枪头制备300μl的等分试样。商店等分于-20℃。 2.新鲜组织收集注意：当与新鲜的人体组织时，研究人员必须遵循预防血源性病原体的传播普遍预防（OSHA），且必须已收到适当的机构培训。适当的个人防护装备，包括手套，保护眼睛，和实验室大衣是必要的。 运输蒸压型过滤（每​​样本之一），高压灭菌，镊子，洗涤缓冲液（大玻璃瓶），收集培养基（每个试样25毫升在50ml锥形管），喷雾瓶，10％的漂白剂，70％的乙醇，组织收集托盘，Sharpie笔和冰桶/冷却器医院/诊所。 注：样品在位于接近工作套房一间研究指定的空间接收。的无菌组织培养罩不是必须的，但应尽快发生收集和研究者应适当消毒的表面，如下所述。 洗的地方大玻璃瓶缓冲相邻的水槽，并用10％漂白剂和70％的乙醇喷雾轴颈。在光源（光垫或光盒）代替玻璃组织收集盘，以及消毒，用10％漂白剂和70％的乙醇。风干。 具有操作套件标本准备室医生随身携带的标本。在宿，倒顶上无菌手持式过滤器样品，冲洗组织数次被H缓冲液，并在缓冲传输整个标本消毒玻璃盘顶上的光源。 注意：由临床医生组织的评估是最高优先级，从而后临床医生已经口头表明他/她完成了评估以下步骤仅执行。 使用无菌镊子选择用于收集胎盘绒毛和蜕膜（ 图2A和3A），并且转移到分离50ml锥形管中。标签与胎龄管。 注意：首选胎龄是小于9周，小于16周的胎盘分别和蜕膜。在该机构中，只有每个试样的一小部分采购用于研究目的，因为足够的组织必须保持为临床病理诊断。 冰的研究实验室的存储和运输标本。 收集多个样品，消毒玻璃盘上方，用10％漂白剂和70％的乙醇的山口之间所描述每个试样的ction。 3.器官培养板的制备注意：应该在组织培养罩使用无菌技术来执行下面的步骤。它是理想的解剖显微镜将设在一个无菌区域。然而，如迅速进行显微解剖，并且仪器在70％乙醇经常浸入这是不是只要绝对必要的。 解冻ECM样品瓶上冰。稀释ECM 1：1用冰冷的作品集媒体，吹打混匀。吸管慢慢地避免引入气泡。 6孔组织培养板的各孔中，需要100微升该悬浮液和将容纳3-4器官培养。 地方的transwell插入物（孔径0.4微米）到6孔组织培养板的每个孔中。 涂层的每个Transwell小与ECM /媒体悬浮液的薄层（100微升）插入。 广场上冰板立即进行establishmen器官培养的吨。可替代地，准备前组织收集板，在这种情况下，包装在对位膜，并储存于4℃以备后用。不推荐使用存储超过6小时长的ECM会干出。 4.建立器官培养的注：此步骤介绍了如何将蜕膜器官培养和绒毛器官培养在不同的转孔。组织不接触。有兴趣在共培养技术的研究人员，其中蜕膜和绒毛是与彼此直接接触，可以参考现有文献9,10。 在每次冲洗之间1000 XG在收集媒体和离心冲洗标本的两倍。转移组织到无菌培养皿中，并发生在解剖显微镜的阶段。保持6孔板上相邻的显微镜冰。 微解剖组织，用无菌施普林格解剖剪刀和镊子，建立2-3毫米绒毛器官培养秒（ 图2A）。 注：绒毛器官培养小，良好的血管“树”有2个或3个分支，带有显着外滋养细胞（EVT）电池列11。它利用来自<9周头三个月只标本绒毛组织，如绒毛外滋养细胞侵入ECM最为显着这些年轻的13岁是很重要的。 与著名的EVT细胞列选择良好的血管绒毛。 EVT单元列被可视化为球形，“模糊”，“蓬松”端部（参照图2A中箭头）。 使用无菌镊子对3或4绒毛状树传送到每个Transwell小。调整分支所以树被平放之上ECM和独立成群的分支。 微解剖蜕膜组织用无菌施普林格解剖剪刀和镊子，建立3 mm 3的蜕膜器官培养物（ 图3A）。 注：样品含有两种DIStinct类型蜕膜，蜕膜和顶叶蜕膜capsularis（左，右分别组织碎片， 图3A）。 用剪刀修剪创建3 mm 3的蜕膜碎片的顶叶。蜕膜capsularis不用于这些培养。使用镊子逗走任何凝结母体血液。 使用无菌镊子传输3-4件蜕膜到每个转孔。 加入收藏媒体1毫升到井底部。在37℃下在5％CO 2孵育过夜板进行实验，其中以模仿正常前三个月的胎盘氧张力，维持在相对 ​​缺氧（3％O 2），绒毛器官培养是很重要的。 注：实验室选项包括小型孵化缺氧室适合现有的内部孵化器，或引入外部N 2气体以降低氧浓度的三气培养箱。 加入1 ml绒毛或蜕膜介质（ 标签的乐1）在培养12-16小时的transwell顶的。 注：在培养的第过夜期间缺乏媒体允许外滋养细胞的列侵入（绒毛状培养），和用于组织（包括绒毛和蜕膜）成为牢固地埋入ECM中。根据我们的经验，蜕膜器官文化保持活力72小时和绒毛器官培养96小时。我们建议属于这一期限内的实验端点。 见表1绒毛和蜕膜中的成分。绒毛状介质具有胎牛血清的高百分比，而蜕膜培养基补充有妊娠激素（孕酮，17β雌二醇），该保持蜕膜状态（ 见表1）。 5.编写的L.单核细胞培养注：有关L.的长期存储详细的协议单核细胞 ，以及文化和THI增长脑心脏浸液（BHI）肉汤和琼脂小号生物体请参阅Wang等人 14 选择一个单一的L.从挑染BHI琼脂平板上菌落单核细胞接种和3毫升BHI肉汤。 孵育L.单核细胞培养过夜（16小时），在一个倾斜的位置，在30℃下。 注意：这些文化条件允许细菌生长，达到稳定期L.菌在30℃下，这增加了宿主细胞侵袭15鞭毛。 6.感染L.器官培养的单核细胞增生 温暖的PBS和绒毛或蜕膜中（ 表1）至37℃。 使用无菌镊子除去任何器官培养片未侵入的ECM，并因此在井浮动。 小心吸从透孔的底部媒体。轻轻吹打1毫升战争冲洗上下转孔两次中号PBS为好，小心地之间进行抽吸英寸轻轻吸取1毫升无抗生素的绒毛状或蜕膜介质的上，下的transwell。要小心，不要打扰器官培养。 让组织在无抗生素的培养基孵育至少一个小时，以确保抗生素已被删除。 注：在固定相L.密度菌培养为每毫升约1×10 9个菌落形成单位（CFU）。用于感染器官培养的细菌数应根据经验确定，以满足实验需要。 对于野生型L.菌等感染常规实验表明，强大的入侵与（1毫升每口井媒体4×10 7 李斯特菌 ）1:50稀释过夜。在重悬不含抗生素的绒毛或蜕膜中细菌的适当数量。 从转孔顶吸媒体。轻轻地加入1毫升接种。在37孵育板℃，在5％CO 2，以允许细菌侵入。 通过从上和下转孔抽吸培养基除去细胞外细菌。用温水冲洗PBS两次井。加入1毫升的绒毛或蜕膜媒体辅以50微克毫升-1庆大霉素。在5％CO 2在37℃下孵育板。 注：L。菌等是一种兼胞内细菌，可在细胞外培养基中生长，生长的细胞的内部，并从细胞至细胞传播而无需访问外空间。庆大霉素对细胞外L的杀菌作用菌 ，并且因此允许细胞内L的测量单核细胞的生长，并通过器官培养16传播。 注：可重复L.绒毛和蜕膜器官培养的菌感染5小时孵育时间发生。此外庆大霉素之前孵育时间可以被修改根据实验需要和从头机体ility侵入组织。为了更好地了解解剖部位最易受感染，更短的温育时间可以使用2。 保持在5％CO 2在37℃下板在实验的持续时间。在每天的变化以及全媒体。 注：根据我们的经验，L.单核细胞 -感染蜕膜器官培养保持活力48小时和绒毛器官培养72小时。 7.机关收获文化组织病理学通过在30ml PBS稀释10毫升16％的股票安瓿准备4％多聚甲醛的全新解决方案。商店4％多聚甲醛在4℃，避光，并在一周内使用。带给在使用前室温。 从上下的transwell抽吸介质。用PBS在室温下轻轻漂洗孔两次。轻轻加入1ml 4％多聚甲醛到顶部Transwell小到完全覆盖器官培养。 孵化在4％多聚甲醛在室温下20分钟。避免潜伏期较长时间，因为这可能会导致组织的过度固定。 抽吸的多聚甲醛和冲洗孔用PBS两次在室温下。埋置在低温恒温器华侨城中等，冻结和部分固定器官培养（“固定冻结”）。一般来说，固定冷冻组织更容易比部分冷冻组织，恕不另行固定。 注：有关OCT包埋和冰冻切片完整的协议，请从公布的协议17,18访问相关章节。根据实验的需要和可用的实验室设备和存储，组织可以改为石蜡包埋并切片上的切片19。 进行常规苏木HE染色，免疫，或免疫组织化学18,20,21进一步准备组织切片。