A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (<em> Terrestris do Bombus</em>)
Summary
A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Abstract
Polinizadores generalistas como a abelha-atado lustre, Bombus terrestris, encontrar ambos os nutrientes e toxinas no néctar floral que coletamos de plantas com flores. Apenas alguns estudos têm descrito as respostas gustativos de abelhas em direção toxinas nos alimentos, e estes experimentos utilizaram principalmente a resposta de extensão probóscide em abelhas produtoras de mel contido. Aqui, um novo ensaio comportamental é apresentado para medir as respostas de alimentação de liberdade de movimento, cada trabalhador abelhas para nutrientes e toxinas. Este ensaio mede a quantidade de solução ingerida por cada abelha e identifica como saborizantes nos alimentos influenciar a microestrutura do comportamento alimentar.
As soluções são apresentadas em um tubo microcapilar para as abelhas individuais que tenham sido previamente carente de 2-4 hr. O comportamento é capturado em vídeo digital. A estrutura fina do comportamento alimentar é analisado continuamente por atingir a posição do Proboscis (bucais) de gravações de vídeo usando o software de log de eventos. A posição da tromba é definido por três diferentes categorias comportamentais: (1) tromba é estendido e em contacto com a solução, (2) tromba é estendido, mas não em contacto com a solução e (3) tromba é guardado debaixo da cabeça. Além disso, a velocidade de retracção da tromba de distância a partir da solução também é estimado.
No presente ensaio o volume da solução consumida, o número de ataques de alimentação, a duração dos episódios de alimentação e a velocidade de retracção da tromba após o primeiro contacto é utilizado para avaliar a actividade phagostimulatory ou o impedimento dos compostos testados.
Este ensaio gosto nova permitirá que pesquisadores para medir como compostos encontrados no néctar influenciar o comportamento alimentar de abelhas e também será útil para os biólogos polinização, toxicologistas e neuroethologists estudando sistema gosto do bumble.
Introduction
interações planta-polinizador são complexas. Polinizadores visitam flores para a obtenção de néctar e pólen como alimento; por sua vez, polinizadores facilitar a reprodução sexual em plantas. Enquanto esta relação é principalmente mutualista, o néctar floral e pólen, por vezes contêm toxinas ou outra planta compostos 1-5 o que pode prejudicar polinizadores. A lógica ecológica para a presença desses compostos no néctar e pólen não é claro em todas as configurações. Uma questão pendente neste campo é como polinizadores, como as abelhas podem detectar e evitar as flores com néctar contendo toxinas.
As espécies de abelhas bumble, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), é um polinizador generalista que visita as flores de muitas espécies de plantas, incluindo os néctar produzir toxinas contendo 6. As abelhas foram mostrados para evitar soluções consumindo contendo altas concentrações de toxinas num ensaio de 24 h duas-7 escolha. este ensaiodo consumo de alimentos descrito por Tiedeken et al. 7 revelou que as abelhas podem detectar compostos amargos em soluções. No entanto, este ensaio foi incapaz de distinguir o gosto dos processos pós-ingestivo, tais como mal-estar que podem afetar o comportamento alimentar durante este intervalo de tempo 8-10.
As abelhas possuem sensilla gustativa em suas antenas, peças bucais e tarsos para detectar compostos 11-13. O reflexo de extensão probóscide (PER) experimentos envolvem restringindo abelhas individuais em um chicote de fios e, em seguida, estimulando sensilas antenais da abelha para produzir a alimentação reflexo 14-17. As abelhas pode ser contido em arneses individuais e, em seguida, estimulada para produzir o reflexo de alimentação como um ensaio da sua capacidade de provar compostos 18,19. Outros têm modificada do ensaio PER para estudar a sensibilidade do aparelho bucal ou antenas de toxinas 9,20. No entanto, as abelhas são submetidos ao estresse durante aproveitamento. Isso pode afetar a forma comoeles respondem a compostos 21.
Aqui, um novo ensaio é descrito para avaliar a resposta ao gosto comportamental de livremente mover as abelhas para sacarose e quinino, um alcalóide que foi previamente relatado para ser dissuasivo 9 e tóxica 10 para as abelhas (Apis mellifera) e abelhas (Bombus terrestris) 7, 22. Embora quinina não foi encontrado no néctar planta, este alcalóide é frequentemente utilizado como um estímulo aversivo em estudos comportamentais e fisiológicas em abelhas 7,9,12,13,22. O método envolve a gravação de peças bucais das abelhas bumble vídeo em ótima resolução durante o contato tromba inicial com as soluções de ensaio. Especificamente, a estrutura fina da resposta de alimentação é examinado por conseguir continuamente o comportamento ao longo de um intervalo de 2 min. O volume de solução consumida é medida durante o período de alimentação e assim a quantidade de comida ingerida pode ser correlacionada com a microestrutura deo comportamento de alimentação. Também a velocidade de retracção da tromba é medida, como um indicador de uma evitação activa, e, por conseguinte, a detecção pré-ingestivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com este romance ensaio comportamental, quinino é mostrado para impedir a alimentação da abelha rabo-de-buff. O tempo de contato tromba reduzida e frequência de ataque de alimentação com água ou a solução de sacarose atado com quinino é interpretada aqui como uma recusa de iniciar ainda alimentando-se de soluções não nutritivos ou potencialmente tóxicos. Quando quinina é adicionado à solução de 1 M de sacarose, as abelhas não só reduzir o volume de solução que consomem, eles também retrair a tromba mais rápido, reduzindo assim o tempo de contacto entre as mandíbulas e a solução contendo uma toxina. Juntos, estes resultados sugerem que o quinino é percebida pelas células receptoras gustativas nas peças bucais da abelha, como já anteriormente identificados no mel de abelha 9. A quinina é uma toxina para insetos que induz comportamento mal-estar, como no mel de abelha 10 e knockdown no mosquito da malária (Anopheles gambiae) 23. Este ensaio pode muito bem levar ao identification de alguns compostos de dissuasão e potencialmente tóxicos que são percebidos pelas células receptoras gustativas nas peças bucais nas abelhas.
É crucial para o tubo microcapilar para ser preenchida com um volume suficiente de solução de ensaio para durar durante toda a fase de teste. Recomenda-se que, pelo menos, cerca de três quartos do tubo microcapilar (por exemplo, 70-80 ul) é preenchido. No entanto, deve ser tomado cuidado para não encher completamente o tubo microcapilar para reduzir o risco de derrames durante o processo de digitalização e prender o tubo microcapilar para o aparelho experimental. Cuidados também devem ser tomados ao apresentar a gota de sacarose 500 mM à abelha, de modo que o experimentador evita vazamento a gota dentro do tubo de exploração.
O buraco 4 mm na ponta do tubo de retenção é grande o suficiente para um adulto trabalhador bumble abelha para estender naturalmente sua tromba na direção da solução de teste. No entanto, é possível quebumble abelhas pode saborear a solução com suas antenas antes de estender as suas trombas. Isso pode afetar a probabilidade de extensão probóscide como PER poderia ser atingida em abelhas, estimulando suas antenas com uma solução de açúcar 15. Na verdade, a antenas de Hymenoptera como a vespa parasita (Trissolcus brochymenae) 24 ou a abelha 13 estão equipados com sensilla gosto, o que lhes permite saborear açúcares e toxinas como o quinino. Consequentemente, contatos antenais iniciais com soluções contendo compostos altamente dissuasão, como o quinino também poderia reduzir a motivação de uma abelha para estender sua tromba e, portanto, afetar a taxa de sucesso experimental. Embora o contato antenal com a solução de teste não pode ser controlada, no presente estudo, não encontramos qualquer efeito significativo de contato antenal na extensão probóscide para a solução de teste. Neste ensaio, imediatamente a configuração do tubo microcapilar após a fase de pré-teste when antenas das abelhas bumble ainda estão dentro do tubo de retenção pode reduzir a oportunidade para as abelhas para saborear a solução de teste com suas antenas.
A principal limitação deste ensaio surge quando acompanhando a retração tromba longe da solução de teste após o primeiro contato tromba usando o software de rastreamento de movimento de vídeo. O vídeo mostra apenas o movimento 2D dos probóscide, então a saída dada da medição da velocidade pode ser sob ou sobre estimado. No entanto, com algumas modificações, este aspecto do ensaio pode ser melhorada.
Este ensaio pode ser usado para observar as respostas de alimentação natural para soluções contendo diferentes compostos, incluindo metabólitos secundários de plantas naturais que ocorrem. Observando as respostas de alimentação imediatos com este ensaio dá informações detalhadas sobre como as abelhas detectar estes compostos. Isto é vantajoso em relação existente 'go-no ir "métodos como PER 18,19 </sup> E mais ensaios de duas escolha 7 porque este método produz várias medidas de resposta comportamental, incluindo o consumo de alimentos durante um ataque de alimentação discreta.
Medição de vários parâmetros simultaneamente permite uma melhor avaliação da palatabilidade de um composto. Por exemplo, em nosso ensaio, as abelhas evitar consumir água ou a solução de sacarose atado com quinino. Retracção da tromba poderia ser causada por uma alteração nas respostas das células receptoras açúcar 12,13. Nosso ensaio mostra que as abelhas retrair a tromba mais rápida depois de entrar em contato com a solução de sacarose mais quinino do que a água só; isso poderia sugerir que o quinino afeta um conjunto distinto de neurônios, além de inibir neurônios de detecção de açúcar 9,12,13,25.
O nosso ensaio permite a análise do padrão temporal de respostas comportamentais durante a alimentação. Um protocolo semelhante onde o consumo de tempo e o número de acessos é medida tem aipronto foram implementadas para avaliar a resposta de alimentação de Drosophila aos açúcares nutritivos e não nutritivos 26. Prevemos que as abelhas irá apresentar uma resposta mais fiável para alimentar estimulantes no nosso ensaio do que em outros métodos, tais como por porque as abelhas são livres para se moverem no tubo de retenção 21. Esta técnica irá permitir uma análise exaustiva dos limiares de sabor para os nutrientes e toxinas para iluminar os mecanismos de alimentação em abelhas e potencialmente outras espécies de abelhas.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela concessão Leverhulme Trust (RPG-2012-708) e uma subvenção BBSRC (BB / M00709X / 1) para GAW.
Materials
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
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