رواية السلوكية الفحص المعنية بالتحقيق في الردود ذوقي الفردي، بحرية يتحرك النحل تلعثم (<em> Bombus تيريستريس</em>)
Summary
A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Abstract
الملقحات اختصاصي مثل النحلة تلعثم الذيل برتقالي، Bombus تيريستريس، تواجه كل من المواد الغذائية والسموم في رحيق الأزهار التي يجمعونها من النباتات المزهرة. فقط ووصف عدد قليل من الدراسات الردود الذوقية النحل نحو السموم في الغذاء، وهذه التجارب قد تستخدم أساسا للاستجابة تمديد خرطوم على نحل العسل ضبط النفس. هنا، يتم تقديم الفحص السلوكي جديد لقياس ردود تغذية بحرية الحركة، العامل الفرد النحل تلعثم إلى المواد الغذائية والسموم. هذا الاختبار يقيس كمية من حل تناولها من قبل كل نحلة تلعثم ويحدد كيف tastants في الغذاء تؤثر على المجهرية للسلوك التغذية.
يتم عرض الحلول في أنبوب microcapillary للنحل تلعثم الفردية التي تم تجويع سابقا لمدة 2-4 ساعة. يتم التقاط السلوك على الفيديو الرقمي. ويتم تحليل التركيب الدقيق للسلوك التغذية بتسجيله باستمرار موقف بروبوالمصارف الإنمائية المتخصصة (فمها) من تسجيلات الفيديو باستخدام برنامج تسجيل الأحداث. ويعرف موقف خرطوم من ثلاث فئات سلوكية مختلفة: تم تمديد (1) خرطوم وفي اتصال مع الحل، تم تمديد (2) خرطوم ولكن ليس في اتصال مع حل و (3) خرطوم هو محفوظ تحت الرأس. وعلاوة على ذلك يقدر أيضا سرعة خرطوم التراجع بعيدا عن الحل.
في مقايسة الحالي حجم حل تستهلك، وعدد من نوبات التغذية، ويستخدم مدة نوبات التغذية وسرعة التراجع خرطوم بعد أول اتصال لتقييم phagostimulatory أو النشاط الرادع للمركبات اخضعت للاختبار.
وهذا الاختبار طعم جديد تسمح للباحثين لقياس مدى المركبات الموجودة في الرحيق التأثير على سلوك تغذية النحل وستكون مفيدة لعلماء الأحياء التلقيح، السميات وneuroethologists دراسة نظام طعم النحلة تلعثم أيضا.
Introduction
التفاعلات مصنع الملقحات معقدة. الملقحات زيارة الزهور للحصول على الرحيق وغبار الطلع كغذاء. بدوره، الملقحات تسهل التكاثر الجنسي في النباتات. بينما هذه العلاقة هي في معظمها المنفعة المتبادلة، رحيق الأزهار وحبوب اللقاح يحتوي أحيانا السموم أو النباتية الأخرى يضاعف 1-5 والتي يمكن أن تضر الملقحات. الأساس المنطقي البيئي لوجود مثل هذه المركبات في الرحيق وغبار الطلع ليست واضحة في جميع الظروف. وثمة مسألة معلقة في هذا المجال هو كيف ملقحات مثل النحل يمكن الكشف عن وتجنب الزهور مع رحيق تحتوي على السموم.
الأنواع نحلة تلعثم، تيريستريس Bombus (لينيوس، 1758)، هو الملقحات اختصاصي أن يزور الزهور للعديد من الأنواع النباتية بما في ذلك تلك التي تنتج الرحيق تحتوي على السموم 6. وقد تبين أن النحل تلعثم لتجنب الحلول المستهلكة التي تحتوي على تركيزات عالية من السموم في مقايسة 24 ساعة اثنين الاختيار 7. هذا الاختبارمن استهلاك المواد الغذائية التي وصفها Tiedeken وآخرون. 7 كشفت أن النحل يمكن الكشف عن المركبات المريرة في الحلول. ومع ذلك، كان غير قادر على تمييز الطعم من عمليات ما بعد ابتلاعي مثل الشعور بالضيق التي يمكن أن تؤثر أيضا سلوك التغذية خلال هذا الوقت الفاصل 8-10 هذا الاختبار.
النحل تمتلك الشعيرات الذوقية على من الهوائيات، فمها والجفن للكشف عن المركبات 11-13. منعكس تمديد خرطوم (PER) تجارب تنطوي على تقييد النحل الفردية في تسخير ومن ثم تحفيز الشعيرات antennal النحل لإنتاج التغذية منعكس 14-17. النحل يمكن أن تمارس ضبط النفس في يسخر الفردية وبعدها سعى لانتاج منعكس التغذية باعتبارها فحص قدرتها على تذوق المركبات 18،19. عدلت الآخرين فحص PER لدراسة حساسية هوائيات أو فمها للسموم 9،20. ومع ذلك، يتعرض النحل للإجهاد خلال تسخير. وهذا يمكن أن تؤثر على كيفيةانهم الرد على المركبات 21.
هنا، يتم وصف فحص جديد لتقييم استجابة طعم السلوكية للبحرية الحركة النحل تلعثم إلى السكروز والكينين، قلويد الذي سبق وذكرت أن يكون رادع 9 وسام 10 على نحل العسل (mellifera أبيس) والنحل تلعثم (Bombus تيريستريس) 7 و 22. وعلى الرغم من عدم العثور الكينين في رحيق النباتات، وغالبا ما يستخدم هذا قلويد لأنها تشكل حافزا مكره في الدراسات السلوكية والفيزيولوجية في النحل 7،9،12،13،22. الأسلوب ينطوي على تسجيل الفيديو فمها النحل تلعثم "في قرار كبير خلال اتصال خرطوم الأولي مع حلول الاختبار. على وجه التحديد، يتم فحص التركيب الدقيق للاستجابة للتغذية بتسجيله باستمرار السلوك على مدى فترة 2 دقيقة. يتم قياس حجم حل المستهلكة أثناء فترة الرضاعة وحتى كمية الطعام التي يتم تناولها يمكن أن يرتبط مع المجهريةسلوك التغذية. كما يتم قياس سرعة التراجع خرطوم، كمؤشر لتجنب نشطة، وبالتالي كشف قبل ابتلاعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع هذا الاختبار السلوكي الرواية، ويظهر الكينين لردع التغذية من تلعثم نحلة الذيل برتقالي. ويفسر انخفاض الوقت خرطوم الاتصال والتغذية تردد نوبة مع الماء أو محلول السكروز الذي تغلب عليه اسهم مع الكينين هنا على أنه رفض لبدء مزيد من تتغذى على الحلول غير الغذائية أو يحتمل أن تكون سامة. عند إضافة الكينين إلى 1 M حل السكروز والنحل تلعثم لا يقلل فقط من حجم محلول يستهلكونه من الطاقة فإنهم أيضا سحب خرطوم أسرع، وبالتالي تقليل وقت الاتصال بين فمها ومحلول يحتوي على مادة سامة. معا، وتشير هذه النتائج إلى أن الكينين يتصوره الخلايا المستقبلة للالذوقية على فمها من النحلة تلعثم، كما سبق تحديدها سابقا في عسل النحل 9. الكينين هو السم للحشرات أن يدفع سلوك مثل الشعور بالضيق في عسل النحل 10 وضربة قاضية في البعوض والملاريا (بعوض الملاريا) 23. هذا الاختبار يمكن أن يؤدي أيضا إلى identificatأيون بعض رادع ويحتمل أن تكون سامة المركبات التي ينظر إليها من قبل خلايا الذوق مستقبلات على فمها في النحل تلعثم.
ومن الأهمية بمكان لأنبوب microcapillary المراد شغلها مع كمية كافية من محلول الاختبار إلى آخر طوال مرحلة الاختبار. فمن المستحسن أن ما لا يقل عن حوالي ثلاثة أرباع أنبوب microcapillary (على سبيل المثال 70-80 ميكرولتر) شغل. ومع ذلك، ينبغي الحرص على عدم ملء تماما أنبوب microcapillary للحد من خطر تسرب أثناء عملية المسح الضوئي وربط أنبوب microcapillary لجهاز تجريبي. وينبغي أيضا توخي الحذر عند تقديم 500 ملي قطرة السكروز إلى تلعثم نحلة، بحيث المجرب يتجنب تسرب الحبرية في أنبوب القابضة.
حفرة 4 مم في طرف الأنبوب عقد كبير بما فيه الكفاية لشخص بالغ عامل تلعثم نحلة تمديد طبيعي خرطوم تجاه حل الاختبار. ومع ذلك فمن الممكن أنالنحل تلعثم يمكن تذوق حل مع الهوائيات الخاصة بهم قبل تقديم proboscises بهم. وهذا قد يؤثر على احتمال تمديد خرطوم كما PER يمكن استخلاصها في النحل تلعثم من خلال تحفيز الهوائيات الخاصة بهم مع محلول السكر 15. في الواقع تم تجهيز هوائيات من غشائيات الأجنحة مثل دبور الطفيل (Trissolcus brochymenae) 24 أو عسل النحل 13 مع الشعيرات طعم، والسماح لهم لتذوق السكريات والسموم مثل الكينين. ونتيجة لذلك، يمكن أن الاتصالات الأولية مع antennal الحلول التي تحتوي على مركبات الرادعة للغاية مثل الكينين أيضا أن يقلل من الحافز للنحلة تلعثم لتوسيع خرطوم، وبالتالي تؤثر على معدل نجاح التجربة. على الرغم من أن الاتصال antennal مع حل الاختبار لا يمكن السيطرة عليها، في هذه الدراسة لم نجد أي أثر ملموس للاتصال antennal على تمديد خرطوم تجاه حل الاختبار. في هذا الاختبار، ووضع على الفور الأنبوب microcapillary بعد مرحلة ما قبل الاختبار ثالدجاجة هوائيات النحل تلعثم "لا تزال داخل أنبوب عقد يمكن أن تقلل من فرصة للنحل تلعثم لتذوق حل الاختبار مع الهوائيات الخاصة بهم.
القيد الرئيسي من هذا الاختبار ينشأ عندما تتبع تراجع خرطوم بعيدا عن حل اختبار بعد الاتصال خرطوم الأول باستخدام برنامج تتبع الحركة الفيديو. لقطات فيديو يعرض سوى حركة 2D للخرطوم، وبالتالي فإن ناتج معين للقياس سرعة يمكن أن يكون تحت أو فوق المقدرة. ولكن مع بعض التعديلات، ويمكن تحسين هذا الجانب من الفحص.
هذا الاختبار يمكن استخدامها لمراقبة ردود التغذية الطبيعية نحو الحلول التي تحتوي على مركبات مختلفة بما في ذلك المركبات الثانوية النباتية الطبيعية التي تحدث. مراقبة ردود تغذية فورية مع هذا الاختبار يعطي معلومات مفصلة حول كيفية يكتشف النحل تلعثم هذه المركبات. هذا هو مفيد أكثر الحاليين الذهاب لا تذهب "أساليب مثل PER 18،19 </sup> وخلال فحوصات اثنين من الخيارات 7 لأن هذا الأسلوب ينتج العديد من تدابير الاستجابة السلوكية بما في ذلك استهلاك الغذاء خلال نوبة تغذية منفصلة.
قياس العديد من المعلمات يسمح في الوقت نفسه إجراء تقييم أفضل للاستساغة من مركب. على سبيل المثال في مقايسة لدينا، والنحل تلعثم تجنب الماء أو محلول السكروز الذي تغلب عليه اسهم مع الكينين طويلا. يمكن أن يكون سبب تراجع للخرطوم عن تغيير في استجابات الخلايا المستقبلة للسكر 12،13. يظهر لدينا فحص أن النحل تلعثم تتراجع خرطوم أسرع بعد الاتصال السكروز بالإضافة إلى الكينين حل من الماء وحده. وهذا يمكن أن تشير إلى أن الكينين يؤثر على مجموعة متميزة من الخلايا العصبية بالإضافة إلى تثبيط الخلايا العصبية الاستشعار عن السكر 9،12،13،25.
يسمح لنا فحص تحليل نمط الزمني من الاستجابات السلوكية أثناء الرضاعة. بروتوكول مماثل حيث يتم قياس الوقت الاستهلاك وعدد نوبات له اللهتم تنفيذها على استعداد لتقييم الاستجابة للتغذية من ذبابة الفاكهة إلى السكريات الغذائية وغير الغذائية 26. نتوقع أن النحل سوف يحمل استجابة أكثر موثوق بها لتغذية المنشطات في فحص لدينا من في وسائل أخرى مثل PER لأن النحل أحرار في التحرك في أنبوب عقد 21. وهذه التقنية تسمح تحليلا شاملا للعتبات طعم المواد الغذائية والسموم لإلقاء الضوء على آليات التغذية في النحل تلعثم وأنواع النحل الأخرى المحتملة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل منحة Leverhulme الثقة (RPG-2012-708) ومنحة BBSRC (BB / M00709X / 1) لأسبوع العمل العالمي.
Materials
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
Referencias
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I., Gilbert, L. E., Raven, P. H. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. , 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce ‘malaise’ behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25 (2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal ‘bitter’ taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388 (2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -. C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667 (2015).
