Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em> Coxiella burnetii</em> Pendant siRNA Silencing

Coxiella burnetii est un pathogène intracellulaire unique qui provoque la zoonotique infection humaine fièvre Q. Cette maladie est associée à un large éventail de présentations cliniques s'étendant de séroconversion asymptomatique à une infection chronique potentiellement mortelle qui se manifeste souvent endocardite ans après l' exposition ^1. L'infection humaine se produit principalement par l'inhalation d'aérosols contaminés avec ruminants le principal réservoir d'infection, en particulier, les vaches laitières, les moutons et les chèvres. Bien que l' infection Coxiella chez ces animaux est généralement subclinique, l'infection peut déclencher l' avortement et la charge bactérienne considérable dans le fluide de l' accouchement et le placenta peut contaminer l'environnement local ^1. Un exemple de l'énorme fardeau telle contamination peut avoir sur la santé publique et l'industrie de l' agriculture a récemment été observée dans l'épidémie de fièvre Q qui a eu lieu aux Pays – Bas ^2. Entre 2007 et2010, plus de 4000 cas humains de fièvre Q ont été diagnostiqués et cette épidémie était liée à une contamination importante des exploitations caprines ^3. En outre, Coxiella est une arme biologique potentielle, classé par les US Centers for Disease Control and Prevention, en raison de la stabilité de l' environnement des bactéries et une faible dose infectieuse nécessaire pour provoquer la morbidité et de la mortalité ⁴ sévère.

Coxiella existe en deux phases: Phase I organismes, isolées à partir de sources naturelles, sont extrêmement virulents et les organismes de la Phase II sont fortement atténués in vivo. Par exemple, après quelques passages in vitro dans des Coxiella burnetii phase I Nine Mile organismes, les bactéries de phase II ont été produits qui contiennent une délétion chromosomique irréversible résultant en un lipopolysaccharide tronqué (LPS) ^5. Cette souche, C. burnetii NMII, est phénotypiquement similaire à la phase I dans les modèles de culture de tissus et fournit un mode plus sûrl pour les chercheurs pour étudier la pathogenèse Coxiella dans les laboratoires ^5. Au cours des dernières années , plusieurs avancées ont rapidement fait progresser le domaine de la génétique Coxiella. Plus particulièrement, le développement des médias axénique (acidifié milieu de cystéine citrate – ACCM-2) a permis la croissance sans cellule de Coxiella à la fois liquide et sur ​​des supports solides ^6,7. Cela a entraîné des améliorations directes des outils génétiques disponibles pour Coxiella , y compris un système d'expression génique inductible, des vecteurs navettes et des systèmes de transposon aléatoires ^8-11. Plus récemment, deux méthodes d'inactivation du gène ciblé ont également été mis au point, ouvrant la voie à l' examen des gènes candidats de virulence spécifiques ^12.

Après intériorisation par les macrophages alvéolaires, Coxiella réplique à un nombre élevé dans un compartiment lié à la membrane appelée Coxiella- contenant des vacuoles (CCV). Le CCV nécessite le trafic d'endocytose hôte eendosomes précoces et tardives rugueux jusqu'à ce qu'il arrive à maturité dans un organite lysosome dérivé ^13. Tout au long de ce processus, le CCV acquiert des facteurs hôtes qui soit apparaissent transitoirement ou restent associés à la vacuole, y compris, mais sans s'y limiter, Rab5, Rab7, CD63 et ^{LAMP-13 à 15 janvier.} Réplication de Coxiella dans les cellules hôtes est entièrement dépendante d' un type Dot / Icm système entièrement fonctionnel IVB Sécrétion (T4SS) ^8,16,17. Ce système de sécrétion est une structure multi-protéique héréditairement liés aux systèmes de conjugaison et englobe à la fois les membranes bactériennes et vacuolaires pour délivrer des protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans le cytoplasme de l' hôte ^18. Le Coxiella T4SS est fonctionnellement très similaire au type IVB Dot / Icm système Sécrétion bien caractérisé de Legionella pneumophila ^19,20. Fait intéressant, l' activation de l'effecteur translocation T4SS et ultérieure ne se produit pas jusqu'à ce que Coxiella atteint le lysosome dérivé acideorganite, environ 8 heures post-infection ^17,21. À ce jour, plus de 130 effecteurs Dot / Icm ont été identifiés ^9,17,22-24. Beaucoup de ces effecteurs jouent probablement un rôle important lors de la réplication de Coxiella dans les cellules hôtes; cependant, seuls quelques effecteurs ont été caractérisées fonctionnellement ^25-29.

Dans cette étude , nous utilisons une translocation dosage par fluorescence à base qui repose sur le clivage du substrat FRET CCF2-AM (ci – après dénommé le substrat BlaM) via l' activité β-lactamase dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 1). Le gène d'intérêt est fusionnée à TEM-1 β-lactamase (BlaM) sur un plasmide rapporteur qui permet une expression constitutive. Le substrat BlaM est composé de deux fluorophores (coumarine et fluorescéine) qui forment une paire FRET. L'excitation des résultats de la coumarine dans la case de la fluorescéine et le vert émission de fluorescence en l'absence d'effecteur translocation; cependant, si le BlaM effecteur protéine de fusion subit une translocation dans le cytoplasme de l'hôte, la résultante β-lactamase activité clive la bague β-lactame du substrat BlaM, séparant la paire de FRET produisant une émission de fluorescence bleue après excitation. Ce test de translocation a été éprouvée comme une approche pour identifier les protéines effectrices à partir d' une gamme de différentes bactéries intracellulaires et extracellulaires, y compris C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, entéropathogènes E. coli, Salmonella et Brucella ^17,30-35.

Pour déterminer le rôle des facteurs de l' hôte spécifiques sur Coxiella effecteur translocation nous utilisons une méthode bien établie pour l' inactivation de gène connu comme l' interférence ARN, en particulier les petits ARN interférents (siRNA). Initialement identifié dans Caenorhabditis elegans, l' interférence ARN est un processus cellulaire endogène conservé utilisé pour defe innéense contre les virus, ainsi que régulation des gènes ^36,37. Après la liaison de siRNA spécifique de la séquence, la dégradation de l' ARNm se produit à travers RISC (complexe taire induite par l' ARN) conduisant à l' inactivation de gène spécifique ou knockdown ^38. Dans cette étude, l'ARNsi a été utilisé pour cibler deux protéines de l'hôte, et RAB5A Rab7A, qui sont des régulateurs importants de la voie d'endocytose. L'impact du silence RAB5A et Rab7A sur effecteur translocation a été établie à l' aide C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 a été choisi car il a été montré précédemment translocation par le système de sécrétion de point / Icm de Coxiella ^17.

Utilisant à la fois siRNA silençage génique et le test de translocation fluorescencebased décrit ici, nous commençons à établir un rôle de facteurs de l' hôte dans la translocation des protéines effectrices par Coxiella. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de bactéries intracellulaires et extracellulaires qui possèdent secretio similairesLes systèmes responsables de la translocation de protéines effectrices n.