应用荧光共振能量转移（FRET）审查效应转运效率由<em>贝氏柯克斯体</em> siRNA沉默中

贝氏柯克斯体是一种独特的细胞内病原体引起人畜共患的人类感染Q热。此疾病与延伸从无症状的血清转化到威胁生命的慢性感染，往往表现为心内膜炎年曝光¹后临床 ​​表现的广谱相关联。人类感染主要通过与反刍动物感染的主要储存器，特别是奶牛，绵羊和山羊污染气溶胶的吸入发生。虽然感染贝氏在这些动物通常是亚临床型，感染可能引发流产和分娩流体和胎盘中的相当细菌量会污染当地环境^1。巨大的负担，这种污染的一个例子可能对公共健康和农业产业化中的Q热疫情发生在荷兰²最近观察。 2007年之间，2010年，Q热4000人感染病例被确诊，这爆发挂山羊养殖场³显著污染。另外， 贝氏是潜在的生物武器，如划分由美国疾病控制和预防中，由于细菌的和必要的低感染剂量的环境稳定性造成严重的发病率和死亡率^4。

贝氏存在于两个阶段：第一阶段的生物体，从天然来源分离的，是非常强毒和II期生物体在体内高度衰减。例如，在贝氏柯克斯体九里期生物体几个体外通路，制作了第二阶段的细菌包含一个不可逆转的染色体缺失导致截短的脂多糖^{（LPS）5。}本品系，C. burnetii NMII，是表型上类似的I期的组织培养模型，并提供一个更安全的模式l对于研究人员研究实验室⁵发病贝氏 。近年来几个突破进展迅速贝氏遗传学领域。最值得注意的是，无菌媒体的发展（酸化柠檬酸半胱氨酸介质- ACCM-2）已经允许贝氏的无细胞生长在液体和固体培养基上^6,7。这导致了包括可诱导的基因表达系统，穿梭载体和随机转座子系统^8-11可贝氏遗传工具直接改进。最近，两种方法靶向的基因的失活也已经开发铺平用于检查特定毒力基因的候选¹²的方式。

肺泡巨噬细胞以下内化， 贝氏复制到高号码的膜-结合的隔室中称为含液泡（CCV）的Coxiella-。该CCV需要主机内吞贩运日粗糙的早期和晚期内涵体，直到成熟为溶酶体衍生的细胞器^13。在这整个过程中，CCV获得，要么出现瞬时或保持与液泡相关联，包括但不限于，Rab5的，RAB7，CD63和^LAMP-1月13日至15日宿主因素。在宿主细胞内的贝氏复制完全依赖于一个全功能点/ ICM型IVB分泌系统^{（T4SS）8,16,17。}此分泌系统是祖先相关的共轭系统多蛋白质结构和跨越细菌和液泡膜提供细菌蛋白，称为效应，到宿主细胞质^18。在贝氏 T4SS在功能上非常相似的特点以及IVB型点/ ICM分泌嗜肺军团菌 ^19,20制度。有趣的是，不会发生T4SS和随后的效应易位激活直到贝氏达到酸性溶酶体衍生细胞器，大约8小时后感染^17,21。迄今为止，已有超过130点/ ICM效应已经确定^{9,17,22-24。}许多这些效应的宿主细胞内的贝氏在复制过程中可能发挥重要作用;然而，只有少数的效应已在功能上表征^25-29。

在这项研究中，我们利用依赖于通过在宿主细胞的细胞质内的β内酰胺酶的活性的CCF2-AM FRET底物（以下简称为BLAM基板）（ 图1）的裂解的基于荧光易位测定。感兴趣的基因融合到TEM-1上的报道质粒，提供组成型表达β内酰胺酶（BLAM）。的BLAM基板由两种荧光团（香豆素和荧光素），该形成FRET对。在荧光素和在不存在效应易位绿色荧光发射的FRET香豆素结果的激励;然而，如果该布拉M-效应融合蛋白易位到宿主胞质，所得β内酰胺酶活性裂解BLAM基板的β内酰胺环，分离FRET对生产下列激发的蓝色荧光发射。这种易位试验得到了证明作为一种方法，从各种不同的细胞内外的细菌，其中包括C.确定的效应蛋白burnetii，L.肺 ，L. longbeachae， 沙眼衣原体 ，肠致病性大肠杆菌 ， 沙门氏菌和布鲁氏菌 ^17,30-35。

为了确定对效应贝氏易位主机特定因素的作用下，我们采用了称为RNA干扰基因沉默一套行之有效的方法，特别是小干扰RNA（siRNA）。原本在秀丽隐杆线虫鉴定，RNA干扰是用于先天防卫厅一个保守的内源性细胞过程对病毒NSE以及基因调节^36,37。序列特异性的siRNA结合后，mRNA的降解通过RISC发生（RNA诱导的沉默复合物），导致特异性基因沉默或击倒^38。在这项研究中，将siRNA用于靶向两个主机的蛋白质，RAB5A和Rab7A，这是内吞途径的重要调节剂。沉默的效应易位RAB5A和Rab7A的影响是用C.确定burnetii pBlaM-CBU0077。 CBU0077被选定为它以前被证明由¹⁷ 贝氏的点/ ICM分泌系统易位。

同时利用siRNA的基因沉默和这里所描述的fluorescencebased易位检测，我们开始建立的效应蛋白通过在贝氏的易位宿主因素的作用。这种方法可以适用于宽范围的具有类似secretio细胞内和细胞外的细菌N个系统负责效应蛋白的易位。