인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포
Summary
여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.
Abstract
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Introduction
중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)는 세포 기반 치료 (1)에서의 사용을위한 유망한 후보로 부상하고있다. 대부분의 응용 프로그램은 MSC 매개 조직 복구 또는 면역 조절 (2)을 대상으로 나타납니다. 이러한 응용 프로그램의 많은에서는 동종 MSC는자가 MSC 3만큼 효과적 일 수있다. 동종 MSC의 사용은 많은 환자를 치료하기위한 단일 소스 조직 (4)로부터 복수의 셀 용량의 대규모 제조와 호환되는 경제적 인 이점을 갖는다.
역사적으로, 전임상 및 임상 연구는 골수 (4)로부터 MSC가 유래 이용했다. 골수는 일반적으로 자원 봉사 기증자의 장골에서 수집됩니다. 이 과정은 침습적이고, 골 (~ 20 ㎖)의 단지 소량의 단일 구멍을 통해 수집된다. MSC의 임상 적으로 의미있는 숫자를 생성하는 체외 확장에 광범위한 필요합니다. 세포 효능 통로 수 감소 <sup> (3), 임상 적 효능에 필요한 세포의 이론적 개수가 더 많은 세포 집단이 팽창 증가 역설 작성. 골수 흡인과는 대조적으로, 용어의 태반은 기증자에 대한 위험없이 제왕 절개 수술시 무균 수확 할 수있는 물리적으로 큰 시작 조직 (일반적으로 5백~7백50g 4)이다. 태반 유래의 MSC는 골수 – 유래 MSC 우수한 장기간 증식 5 및 면역 조절 용량 (6)을 갖는다. 이전의 연구는 단일 용어 태반 최대 7000 임상 용량 (4)의 제조를 위해 충분한 MSC를 함유하는 것으로 보였다. 이러한 특성은 동종 MSC의 제조를위한 이상적인 소스 태반 조직을 만든다.
태반은, 이론적으로 고립 될 수 있습니다 태아 나 산모의 기원의 것을 말하고, 모두 태아와 산모의 조직 (7)로 구성된 기관, 따라서 MSC이다. 다음 참조 드를 제공개발 및 병리에 꼬리 정보뿐만 아니라, 인간 태반 부속기 8,9 현미경 및 육안 검사. 태반은 적절한 융모막의 frondosum (판) (8)에 의해 덮여 융모막 융모를 구성하는, 주로 태아의 혈관과 분비 및 trophoblasts라고지지 세포로 구성되어 있습니다. 지형 태반 융모는 영양, 호르몬 및 태아와 어머니 사이의 가스 교환을 가능하게 자궁 나선형 동맥에서 전달 된 산모의 혈액에서 목욕을하고 있습니다. 태반은 산모의 탈락 기질 세포와 태아 extravillious trophoblasts를 통해 자궁 내막에 고정되어이 세포 외 기질 (8)에 산재되어있다. 융모는 탯줄 (8)을 형성하는 태아의 융모 판에 수렴.
태반 – 유래 줄기 세포에 대한 최초의 국제 워크샵의 결과 (2008)을 분리 및 characterizatio 표준화 필요성의 하락했다인간의 장기 태반 (10)에서 세포의 N. 때문에 태반의 해부학의, 다른 조직의 절개는 MSC의 분리 및 예상 배양 결과는 필드 이민자를위한 압도 할 수있다. 이 프로토콜에서, MSC 분리 및 확장 뒤에 태반 융모 조직의 수확은 철저하게 자세히 설명되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 체외 분화 MSC 특성화 일상 5,11-13 간주하고, 따라서 간략 여기에 자세히 설명되어 있습니다.
최근의 체계적 문헌 고찰 (14)에서 강조 바와 같이, MSC는 태반의 융모막 융모는 일반적으로 태아로 가정에서 얻을. 하지만, 연구의 18 %를 수득 한 MSC의 출처를 조사하고, 그 중, 연구의 절반 태아 MSC 나머지 절반은 모체 또는 혼합 MSC 집단보고를보고 하였다. 본 명세서에 설명 된 세 가지 조직 각 구성 요소 (융모, 융모 접시 탈락 basalis)는 완있다주로 태아 막 / 융모 및 전달 태반에 부착 된 상태를 유지 자궁 모체 유래 세포의 소량의 osed. 우리는 데이터를 모체 MSC 싶은 경우는 우리가 이전 5,11보고 한 바와 같이, 태반의 모체 측보다는 태반 태아 측으로부터 MSC 분리,보다 적절한 출발 물질임을 증명 제공한다. 이 프로토콜은 또한 세포 배양에 태아 나 산모의 기여를 검증하는 XY 생선의 사용을 설명합니다. 이 제조 업체에서 표준 프로토콜 인 반면,이 분석은 종종 무시하고 그 중요성 14을 과소 평가한다.
Protocol
인간의 연구 윤리 이잖아요 보건 서비스에서위원회, 로얄 브리즈번 여성 병원, 기술의 퀸즐랜드 대학과 퀸즐랜드 대학은 연구에 사용 된 인간 태반 샘플의 연구와 수집을 승인했다. 모든 프로토콜은 국가 연구 가이드 라인을 준수. 환자는 연구 목적으로 조직의 사용에 대한 서면 동의를 정보를 제공했다. 세 번째 임신의 태반은 브리즈번, 호주에서 상술 한 병원에서 용어의 일상적인 제왕 절개 (CS) 출생 다음 건강한 어머니로부터 얻었다. 용어 샘플에 대한 남성 불일치 임신은 모체 세포로부터 태아를 구별하기 위해이 연구에 사용되었다. 태아 성별 전에 출생 및 / 또는 임상 직원 출생시 신생아의 육안 검사에 초음파에 의해 결정되었다. 현장 하이브리드 (FISH)에서 X와 Y 염색체 형광 더 성별과에서 보존 된 조직의 태아 나 산모의 출처를 확인하기 위해 사용되었다원래 태반. 1. 이전에 수확하려면 다음을 준비 참고 : 효소 솔루션을 구성하는 경우, 각 제품의 제조업체가 제공하는 특정 요구 사항과 농도를 따라야한다. 효소는 종종 따라서 다른 회사의 유사 효소 다양한 활동 / 농도를 가질 가능성이 단백질의 원유 믹스로 제공됩니다. 이 때문에 제조업체의 조언은 인정해야 및 솔루션 준비 그에 따라 수정해야 할 수 있습니다. 준비 또는 1.5 ~ 2 L 총 구매 멸균이 프로토콜에 대한 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS). 콜라게나 제 I 형을 무게에 의해 콜라게나 제 I 주식 솔루션을 준비하고 부드럽게 완전히 용해을 보장하기 위해 1 밀리그램 / HBSS에서 ml의 소용돌이를 녹인다. 100 단위 (U) / μL (1000 배 스톡 용액)로 콜라게나 제 용액을 가지고 다음 0.2하여 필터링 할 필요 HBSS (칼슘 및 마그네슘을 포함)의 부피를 결정# 181; m 주사기 필터. -20 ° C에서 나누어지는 1 ML의 1.5 ml의 튜브에 볼륨 및 저장소가 필요할 때까지. 칼슘 또는 마그네슘없는 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 중 10 ㎎ / ㎖에 비 멸균 디스 파제를 용해시킴으로써 디스 파제 스톡 용액을 제조 하였다. 또한, 2.4 U / ml의 최종 농도로, 칼슘 또는 마그네슘없이 DPBS로 희석 하였다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 살균 필터. -20 ° C에서 나누어지는 1 ML의 1.5 ml의 튜브 볼륨 및 저장소가 필요할 때까지. 0.15 M NaCl을 10 ㎎ / ㎖에서 DNase의-I를 용해하여 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 (DNase의) -I 주식 솔루션을 준비합니다. 0.2 μm의 주사기 필터 thorugh 필터링합니다. -20 ° C에서 나누어지는 1 ML의 1.5 ml의 튜브 볼륨 및 저장소가 필요할 때까지. 100 U / ㎖의 콜라게나 제 유형을 조합하여 소화 작업 용액을 제조 I, I.5 μg의 / ㎖의 DNase I 및 2.4 U / mL의 디스 파제 무 혈청 DMEM이다. 갓 해동하고 사용하기 직전에 효소 주식을 희석. 대략 1 : 소화 용액을 1 비율조직 부피 체적이 요구되는 (a 50 ㎖ 튜브에서 측정 조직 예 10 ㎖를 소화 용액 10 ㎖가 필요함). PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 용액을 제조하여 pH 7.4 (15)로 조절한다. 스토어 장기 또는 1 주일 동안 4 ° C에서 -20 ° C에서 25 ㎖ 씩. 1X 항생제와 항진균제 용액 및 10 % 비가 열 활성화 된 우 태아 혈청으로 보충 된 DMEM 로우 포도당 (DMEM-LG)에서 MSC 배지를 준비한다. MSC 수준의 FBS 많은 FBS 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. 제도적 지침에 따라 사전에 해부 장비를 소독 압력솥. 이 가위, 핀셋, 메스, 큰 금속 해부 트레이를 포함한다. 추가 무균 조직 배양 plasticware 및 소모품 (예를 들어 메스 블레이드, 50 ㎖, 15 ㎖의 튜브, 25 ml의 10 mL 및 5 ml를 피펫, 75 또는 175cm 2 세포 배양 플라스크)를 수집합니다. 클래스 II B : 표준 주 세포 배양 실험실 장비를 사용하여일차 전지 분리에 적합한 iosafety 캐비닛, 세포 배양 인큐베이터 5 % CO 2, 37 ° C, 37 ° C 배양기에서 로커, 50 ml의 튜브 수용 할 수있는 원심 분리기에 설정합니다. 제도적 지침에 따라 실험실 코트, (항상) 장갑 2 쌍, 안전 안경, 그리고 가까운 터진 신발 : 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. 사전에 제도적 지침 및 액체 생물학적 폐기물 용기에 따라 인간의 혈액 표본에 대한 적절한 오염 제거 솔루션을 준비합니다. 태반 MSC 2. 분리 태반 준비 필요한 개인 보호 장비에 드레스. 효소 소화 (섹션 2.5.6)에 절차를 수행하는 데 필요한 재료, 솔루션 및 폐기물 용기와 생물 안전 캐비닛을 설정합니다. 동의 및 윤리 승인 태반을 얻습니다. 제왕 절개 초를 통해 태반을 수집실험실에 전송을위한 무균 가방이나 양동이에 무균 수술 조건 하에서 기, 및 패키지. 수송 및 이전 해부에 동안 실온 또는 4 ℃에서 태반을 저장합니다. 주 : 조직은 세포 배양 성능에 영향을주지 않고 최대 6 시간 동안 저장 될 수있다. 태반 조직 수집 및 처리 수의 시간을 제한한다. 이 포인트는 실질적인 문제를 기반으로합니다. 일부 경우에서는, 생후 최대 6 시간 동안 세포 분리 과정을 지연하고있다. 이러한 경우 태반을 실온 또는 4 ° C를 (실험실 또는 수집 센터)에서 유지되고있다. 이들은 4 ℃ 또는 실온에서 보존 될 때 검출 가능한 차이는 태반으로부터 얻은 MSC에서 일반 도너 편차 이상 관찰되지 않았다. 생물 안전 캐비닛에서 태반과 용기를 놓습니다. 컨테이너를 열고 살균 트레이에 태반을 전송합니다. 태아 막 (양막 낭 또는 양막-융모 laeve) (8)을 엽니 다. 태반의 부품을 지향하게된다. 태아 측 중앙 태반에 삽입, 일반에 탯줄 삽입을 가지고 있습니다. 태아 측과 반대 (탈락의 basalis 늘어서) 모계 쪽은 분명 자엽 (또는 돌출부)가 있습니다. 해부를 시작하려면, 살균 트레이에 위쪽으로 향하도록 탯줄과 태반의 방향을. 참고 :이 프로토콜은 세 가지 조직 유형의 각각에서 하나 T175 플라스크에 배정 할 수있는 충분한 세포를 얻을 수 있도록 설계되었습니다. 각 다이제스트는 조직의 약 10 g을 시작합니다. 이 20 ml의 골수 흡인에서 시작 MSC 문화로 플라스크의 유사한 시작 번호입니다. 이상의 셀이 요구된다면, 더 많은 조직을 채취 할 수 있고, 프로토콜이 선형 확장 할 수있다. 수확 할 조직의 크기는 태반 조직과 실천이 무엇인지의 지표입니다. 몇 definin이 있습니다기준점으로 사용될 수있는 태반 융모에 g 기능. 표시된 치수는 추정 역할과 탯줄이 태아의 표면에 랜드 마크로서 사용된다. 탈락 (D) 조직의 해부 그래서 산모의 표면 (탈락의 basalis)이 위를 향 통해 태반을 뒤집습니다. 탯줄 삽입 포인트와 태아면이 아래로 향하도록합니다. 태반 (탈락의 basalis 조직을 포함)의 모체 측으로부터 0.5 cm 두께의 조각을 잘라. 수화 조직편을 유지 절개 동안 HBSS를 함유하는 페트리 접시에 조직 조각을 놓는다. (이는 조직을 약 10g이다)을 50 ㎖ 튜브에 10 ㎖ 표시까지 튜브를 채우기에 충분한 조직을 옮긴다. 융모막 플레이트의 해부 (CP) 조직 기계적 쵸를 떠나, 태반 (안 양막 낭)의 태아 표면에서 양막의 제거rionic frondosum (융모 판) 그대로. 융모막 판에서 깊이 0.5 cm로 1cm 폭 ~ 조각을 잘라. 멀리 태반의 가장자리에서 가장 가까운 탯줄에이 지역에서 융모 판을 수확. 수화를 유지하기 위해 해부 동안 HBSS를 포함하는 페트리 접시에 조직 조각을 놓습니다. 10 ml의 표시 (~ 조직의 10g)까지 50 ML 튜브를 채우기에 충분한 조직을 전송합니다. 융모막 융모의 해부 (CV) 조직 CV 조직 ~ 1cm에게 CP가 이미 제거 된 태반 조직에서 깊은 2 × 0.5 cm를 해부하다. 다시 말하지만, 멀리 태반의 가장자리에서 지역 탯줄에 가장 가까운에서 수확 CV. (탈락의 basalis 조직을 포함) 태반의 산모 측에서 멀리 적어도 1cm를 유지하려고; 목표는 태반 융모 조직의 내부로부터 조직을 채취한다. disse 동안 HBSS를 함유하는 페트리 접시에 조직 조각을 놓고수화를 유지하는 ction. 10 ml의 표시 (~ 조직의 10g)까지 50 ML 튜브를 채우기에 충분한 조직을 전송합니다. 닦지 및 D, CP의 효소 소화 및 CV 태반 조직 D의 ~ 10g 있기 때문에, CP 또는 CV 조직은 세 가지 다른 50 ㎖ 튜브, HBSS의 약 40 ml의 각 튜브를 작성하여 반복적으로 조직을 세척하기 위해 튜브를 반전 (10 초 ~에 대한 반복). 뜨는을 가만히 따르다하고, 용액을 혈액에서 크게 될 때까지이 세척 단계를 2 ~ 3 번 반복합니다. 상등액을 경사 때 조직 조각 관 (들)에서 손실되지 않도록 10 ml를 피펫 또는 긴 핀셋을 사용합니다. 최소한의 액체 전송과 10cm 페트리 접시에 조직 조각을 돌려줍니다. 잘라는 / 가위 또는 면도날과 약 1-5mm 3의 미세 조각으로 조직을 말하다. 다시 적절하게 레이블 (D, CP 또는 CV) 50 ㎖ 튜브에 다진 조직을 전송합니다. 갓 위해 준비 할 추가조직 (예를 들어 10 ml의 조직 플러스 미디어 소화 10 mL)로 1 비율 ED 적어도 하나의 미디어 다이제스트. 각각의 튜브에 뚜껑을 교체하고 혼합 튜브를 여러 번 반전. 37 ° C에서 1~2 시간 동안 미디어를 소화와 튜브에 조직을 품어. 가습 분위기와 5 % CO 2는이 단계에서 필요하지 않습니다. 참고 : 빠른 흔들림을 효율적으로 MSC 수율 조직에서 세포를 떼어 놓다 및 극대화하기 위해 필요합니다. 제한 수율은 48 시간 긴 1-2주보다 제 1 통로시 문화 플라스크에 부착 된 소수의 세포에 의해 명백 할 것이다. 배양 시간 떨고 방법은 실험실에서 사용할 수있는 37 ° C를 인큐베이터에 따라 달라집니다 및 최적화가 필요할 수 있습니다. 신속하고 제어 진동기구, 장소 조직과 인큐베이터 및 인큐베이터에서 50 ML 튜브 또는 멸균 삼각 플라스크, 장소에 매체를 소화하고 250 rpm으로 속도를 진동으로 설정합니다. 이는 전체 다이제스트가 발생합니다1 시간에 조직. 또한, 부드러운 락 또는 전혀 요동기구와 인큐베이터에 대해 수동으로 10 초 1.5 ~ 2 시간 동안 매 30 분 동안 손에 의해 신속하고 적극적으로 튜브를 흔들. 효소 배양 기간은 불필요한 항목의 바이오 안전성 캐비닛을 취소 폐기물을 폐기 오염 된 경우 실험실 코트를 변경하고 절차의 다음 부분을 준비 할 수있는 적절한 시간이다. 단핵 세포의 수집 및 술병으로 도금 주 : 이전 단계에서 조직편 소화 세 50 ㎖ 튜브 (D, CP 또는 CV)가있다. 조직 다이제스트 용액이 흐린 외관 진화 흰색 혈관 조직에서 명백한 경우, 소화가 완료된다. 소화 용액에 함유 된 효소를 불 활성화하기 위해 각 튜브에 FBS를 함유하는 MSC 배지 30㎖를 추가. 소화되지 않은 큰 이물질로부터 단핵 세포를 분리하기 위해, 펄스는 50 ㎖ 원심 분리 튜브. 간단히 허용원심 분리기는 340 X에 도달 g 5 초 후 중지합니다. 이 액체 현탁액 중의 단핵구를 남기고, 상기 튜브의 하단에 펠렛 큰 파편을 강제 할 것이다. 주 : 튜브 간략 (펄스) 원심 경우 단핵 세포가 액상으로 유지된다. 원심 분리가 확장되면, 단핵 세포는 바람직하지 않은 세포의 손실의 결과로 조직 조각 튜브의 하단 펠렛 것이다. 단핵 세포를 포함, 상층 액을 수집하고 피펫으로 새로운 50 ML 튜브로이를 전송할 수 있습니다. 나머지 태반 조직 파편에 미디어 또는 HBSS의 30 ML을 추가하고 격렬하게 흔들어. 이 현탁액에 남아있는 분리 된 단핵 세포를 가져 상기 조직으로부터 추정 MSC의 제 수확있게된다. 펄스 원심 분리기 튜브 두 번째로, 다시 새로운 50 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 이 단계 수거 효율을 극대화 할 수있는 세 번째 반복각 조직 소스에서 단핵 세포. 두 개의 50 ㎖ 튜브에 개별 조직 유형의 각각의 상등액을 풀. 이 총 6 튜브 (각각 D, CP와 CV의 2 관)을 얻을 것입니다. 원심 340 x g에서 5 분간 각 튜브. 이 단계는 튜브의 바닥에 단핵 세포 펠렛 것이다. 조심스럽게 가만히 따르다 또는 폐기물로 상층 액을 피펫. 이는 상층 액의 방울을 제거하려고 할 필요가 없다. 주 : 세포 펠렛 때문에 적혈구의 다수 깨지기 것이다. 당신이 50 ML 튜브에서 직접 경사하는 경우 실수로 펠렛을 폐기하지 않도록주의하십시오. 상등액의 대부분을 제거한 후, 부드럽게 세포 펠렛을 제거하기 위해 손가락으로 튜브를 여러 번 가볍게. 각 D, CP 또는 CV 조직에 대한 단일 튜브가되도록, 펠렛을 결합 MSC 배지 35 ㎖에 각각 재현 탁. 선택적 : 100㎛의 메쉬 셀 스트레이너를 통하여 단핵 분획 필터 U 세트50 ML 튜브에서 p는 세포 덩어리 또는 섬유상 물질을 제거합니다. 참고 : 필터가 쉽게 방해 및 이상 필 수 있으므로주의가 필요합니다. 또한, 기포가 배출에서 필터를 방해 할 수 있습니다. 이 경우, 서서히 공기가 새 필터로 세포 배양 배지 또는 익스체인지를 통해 필터를 필터하에 유동 세척 할 수 있도록 튜브의 필터를 올려. 필터링 단계를 제외하면 이후 MSC 문화의 수율이나 품질을 변경 나타나지 않습니다. 선택적으로, 적혈구 (RBC) 용해 또는 밀도 구배 원심 분리는이 단계 15에서 수행 될 수있다. 그러나, 우리의 경험은 RBC는 MSC 첨부 파일 또는 증식하기 때문에 RBC의 용해를 방해하지 않는다는 것입니다 필요가 없습니다. RBC의 제거가 15 행했다 경우 단핵 세포는이 단계에서 계산 될 수있다. 하지만,이 단계에서 세포의 대부분은 MSC 수 있지만, 태아 기원 trophoblasts, 내피 세포 및 조혈 세포뿐만 아니라 MA는 없습니다영원한 원점 조혈 세포와 탈락 기질 세포. 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 단일 T175 플라스크와 문화에 각각 D, CP 또는 CV 조직의 세포 현탁액을 전송하고 5 % CO 2. 포스트 격리 셀 확장 초기 분리 다음 48 시간에, 플라스크 (D, CP 및 CV)의 각각으로부터 매질을 제거하고 신선한 MSC 배지 35 ㎖로 교체한다. 추정 MSC는 조직 배양 플라스크 (16)에 장착 될 것으로 추정되는 것과 소비 매체 분리 세포를 폐기 할 수있다. 추가로 24 시간 동안 인큐베이터에 플라스크를 돌려줍니다. 문화의 추가 24 시간 후, 파편과 적혈구를 제거하는 DPBS (25 ml)로 두 번 플라스크를 씻어. 적혈구을 제거 플라스크의 바닥 주위에 액체 소용돌이 친다. 액체 및 이물질을 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 플라스크에 MSC 미디어의 35 ML을 추가하고 인큐베이터에 플라스크를 반환합니다. 두 번 주, 그리고 미디어를 교체세포 단층 배양까지 cubate 80 90 % 융합 성이다. 이러한 초기 팽창 조직의 품질에 따라 4~14일 소요 다이제스트 용액 물질 효율 배양 개시 시간의 양. pMSCs 3. 비주류 문화 문화가 80-90% 합류 경우, 20 ㎖ 1X HBSS 또는 DPBS로 두 번 세척 및 세척을 폐기합니다. 각 플라스크에 트립신 대신 추가 (즉, T175 플라스크 5 ml를 사용). 조직 배양 표면으로부터 MSC 해방 37 ° C에서 5 분 동안 플라스크를 인큐베이션. 박리를 용이하게하기 위해, 플라스크의 측면마다 ~ 2 분 탭. 세포 표면으로부터 단일 세포 현탁액으로 분리되는 경우, MSC의 미디어 플라스크로부터 세포를 세척 튜브에 세포를 수집한다. 석사 미디어는 희석 (~ T175 플라스크 당 MSC 미디어의 15 ml에 사용) 트립신 – 대체를 비활성화합니다. 50 각 조직 배양 플라스크의 내용물을 전송ML 튜브. 5 분 340 XG에 원심 분리기 튜브는 세포 펠렛합니다. 뜨는을 취소하고 MSC 미디어의 1 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 10 ㎕의 트리 판 블루 세포 현탁액 10 μL 희석. 혈구를 사용하여 세포를 세어 셀 (15)의 총 수를 계산한다. 신선한 MSC 매체에 1,150 세포 / cm 2에서 새로운 플라스크에 세포를 전송하고 조직 문화 인큐베이터에서 배양한다. 이 파종 밀도에서, MSC 미디어의 35 ml의 각 새로운 T175 플라스크에 20 만 MSC 시드. 80-90% 합류 할 때까지 일주일에 두 번 세포를 공급. 1,150 세포 / cm 2 또는 각 T175 플라스크에 넣고 20 MSC에서 다음 구절을 시드. 경우 통로 1 (P1) 또는 P2 세포는 나중에 사용하기 위해 셀의 대부분을 cryopreserve, 또한 전파 및 특성화를위한 단 하나의 T175 플라스크 시드, 컨 플루 언트된다. 전파 셀은 FL을 통해 중배엽 분화 분석법 및 세포 특성화 P3 또는 P4에서 사용될 수있다유동 세포 계측법. 주 : 초기 통로에이 거의 드문 드문 분리 된 콜로니 수 있지만, 각 집단 내의 로컬 셀 밀도가 매우 높을 수있다. 세포의 밀집 지역 패킹 성장을 지연시켜 배양 성능을 감소 접촉 억제 될 것이다 이것은, 이상적이지 않다. 우리는 밀도 식민지가 관찰 될 때, 세포를 수확하고 새로운 플라스크에 다시 시드해야 좋습니다. 이러한 재 분산 처리를 증식 방 셀을 제공하고, 전체 배양 성능이 향상된다. MSC cryopreserve을 위해 90 % FCS 및 10 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 1 ㎖ ~ 1 × 106 세포를 수집하고 표준 프로토콜을 사용하여 동결. 참고 : 대표적인 결과 섹션에서 세 가지 (D, CP 및 CV) 확장 세포 인구의 성별을 결정하는 유동 세포 계측법 사용하여 MSC의 특성, 중배엽 차별화와 XY의 FISH 분석에 대한 설명이 있습니다. 우리의 연구에서 태반은 남자 아기에서 있었다; 따라서 모든태아 세포는 남성 (Y 염색체)로 구분 될 수 있으며, 모든 산모 세포 (만 X 염색체)을 여성으로 구분 될 수있다.
Representative Results
태반 MSC 분리 절차는 MSC가 고립되었던 태반 해부학의 세 가지 영역이 다음은 산모의 탈락뿐만 아니라 융모 판과 융모막 융모의 대부분 태아 조직입니다 그림 2에 강조 표시됩니다 그림 1에 요약되어있다. 많은 교과서, 기사 및 온라인 리소스 세부 개발 및 다양한 태반 조직의 기능적 역할은 (참조 8 참조). 48 시간 분리 및 조직 파편의 제거 후 배양 형태. 적혈구 및 대부분의 다른 세포 파편이 첨부되지 않습니다 동안 문화의 48 시간 후, 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착 된 것입니다. 이때, 배지는 신선한 배지 35 ㎖로 교체되어야한다. 이 배지 교환하기에 앞서 때문에 정확한 관찰을하기 어렵다시각적 평가를 방해 할 적혈구 많은 수의. 배양 상등액의 모양은 태반 기증자 사이에 실질적으로 다를 수 있습니다. 본 변형 예 1 및 2 (도 3a)에 시각적으로 볼 수있다. 매우 다르게 나타나 두 MSC 아이솔레이션은 두 가지 태반에서 동시에 수행 하였다. 그러나, 한번 세정 모두 배양 (세정 실시 예 3,도 3a 참조)와 유사한 나타났다. 현미경 하에서 48 시간 배지 교환 후, 몇 셀 플라스크 (도 3b)에 연결되며, 상기 세포를 더욱 광범위하게 전개 엽 줄기 세포에서 유의 한 차이가 나타날 것이다. 일부 파편과 적혈구 부동 또는 부착 덩어리로 볼 수 이러한는 중간 엽 줄기 세포의 성장을 방해하지 않습니다. 플라스크의 바닥에 부착 된 긴 섬유 아세포 세포가 MSC, 조혈 세포를 포함한 혼합 될 가능성융모 또는 내피 세포. 또, 비 MSC 세포는 이들 세포는 일반적으로 MSC 배양 조건에서보다 1-2 통로 살아남 같이, MSC 배양을 손상하지 않는다. 배양 초기 모양의 일부 변동에도 불구하고, 후속 팽창 결과는 일반적으로 일치한다. 시간이 지남에 MSC 문화의 형태. 비 MSC 세포는 원형으로 볼 수있다 또는 느슨하게 연결된 세포 (그림 4A)가. 첨부 된 세포가 원래 형성 "식민지 장치라고 있었는지되지만이 대표적인 예에서, 분리 다음 칠일은 작은 섬유 모세포 MSC 식민지는 볼 수 있었다 나중에 -fibroblast "(CFU-F) (17)와 MSC (18)라고합니다. 열세 일 격리 다음, 섬유 모세포 MSC 식민지가 큰 (그림 4B)이었다. 일반적으로, 단일 층이 시점에서 80-90% 합류되며 세포 파샤되어야 검정 고시. 통로 (2) 이후부터, 태반 MSC 단일 층이 합류 (그림 4C)의 특성 소용돌이 모양의 형태를 개발합니다. 세포를 낮은 밀도로 계대 않는 한, CFU-F 형성은 더 이상 관찰되지 않을 것이다. 낮은 밀도에서, 태반 유래 MSC는 성인 골수 유래 MSC 1보다 작은, 사각형 모양을 가지고있다. 태반 유래 MSC와 골수 유래 MSC 유사한 증식 속도를 나타내는 반면, 태반 – 유래 세포는 급속 노화 5 이하 쉽다. 체외에서 태반 MSC의 특성. 각 확장 세포 집단은 (1) 플라스틱 접착 (2) 중간 엽 표면 마커의 존재 및 조혈 표면 마커의 부재 및 중배엽를 받아야하기 (3)의 용량을 포함하여 표준 MSC 기준 (16)에 부합하도록있어서해야 분화. "fo를 : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 태반 중간 엽 줄기 세포는 플라스틱 접착 있습니다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 중간 엽 줄기 세포의 배양은 접착 수지이며 섬유 아세포와 같은 형태를 가지고; 이 세포가 MSC (16)를 정의하는 첫 번째 기준을 충족하는지 확인합니다. 태반 MSC 디스플레이 중간 엽 표면 마커. 두 번째 정의 MSC 특성 간엽 표면 마커의 존재 및 조혈 표면 마커 (16)의 부재이다. 결정적은 MSC를 식별 할 수있는 단일 마커가 없기 때문에, 마커의 패널은 일반적 아니라 조혈 간엽있는 셀을 식별하기 위해 유세포 분석과 관련하여 이용된다. 여기에 제공된 대표 데이터 세트에서 (그림 5A), 우리는 중간 엽 마커 CD73, CD105, CD90, CD146, 및 CD44, 조혈 마커 CD45 및 CD34 및 HLA-DR, 아 등의 세포 발현을 평가내피 마커 CD31와 같은 리터. 이 태반 MSC 특성화 과정에 사용되는 항체의 모든 재료 / 장비의 표에 나열되어 있습니다. (가) 여기에 19 설명 분석 방법으로, 지침을 제조 따라 염색을 실시 하였다. 5,20 예상대로 세포, 중간 엽 마커 CD73, CD105, CD44, 및 세포 표면 마커 CD45, CD34, HLA-DR 및 CD31 양성 부정적이었다. 약 37 %와 우리의 대표 데이터 세트에서 세포의 57 %는 각각 CD90와 CD146 (21)에 대한 긍정적이었다. CD90 및 CD146 모두 일반적으로 MSC (21)는 마커 이용된다. MSC 세포 표면 마커 정보는 MSC 조직 소스, 중간 조성물 또는 통로 번호 (22)에 따라 다를 수있다. 경험 다년간에서는 1-2 P하기 비 중간 엽 세포, 태반 – 유래 MSC 장기 오염이 관찰되지 않은assages 5,11. 태반 MSC 디스플레이 중간 엽 분화 가능성 정의에 의하면, MSC는 체외 중배엽 분화 능력 5,13을 가지고 있어야합니다. 중배엽 분화 잠재력은 일반적으로 트리 또는 이중 혈통 차별화 분석 중 하나를 통해 평가된다. 트라이 혈통 분석이 추가로 연골 분화 능력을 평가하는 동안 바이 계보 분석은 일반적으로 골 형성 및 지방 세포 분화 능력을 평가합니다. 여기에 제시된 대표적인 결과에서, 우리는 확장 된 MSC 인구가 두 골 형성 분화를 나타내는 칼슘 예금 및 지질 공포, 지방 조직을 나타내는 (그림 5B)를 형성 것을 보여준다. 여기에보고 된 MSC 집단을 특성화하기 위해 유도 배지 1 ㎖를 6 × 104 세포로 24 웰 배양으로 세포를 시딩. 중간 콤포넌트넌트는 재료 / 장비의 표에 나열되어 있습니다. 유도 매체 제제는 문헌에서 공통적 인 반면, 출판 제제에 상당한 변화가있다. 이러한 이유로 우리는 간단히 여기에 우리의 유도 매체 제제와 염색 방법을 나열합니다. 골 형성 유도 배지는 DMEM-HG 10 % FBS, 1X 항생제 항진균제 용액 된 10 mM β-글리세롤 한 인산, 100 나노 덱사메타손, 50 μM L- 아스 코르 빈산 -2- 인산을 함유 하였다. 지방 세포 유도 배지는 DMEM-HG 10 % FBS, 1X 항생제 항진균제 용액 10 μg의 / ㎖ 인슐린, 덱사메타손 100 나노 미터, 200 μM 인도 메타 신 (indomethacin), 500 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 산틴을 함유 하였다. 여기서 문화는 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 유지되고 14 일 동안 배양 하였다. 유도 매체는 배양 기간 동안 두 번 일주일 교환했다. 유도 14 일 후, 문화는 우리의 이전에 따라 뼈 같은 매트릭스 (골 형성) 또는 지질 액포 (지방 조직) 중 하나를 위해 특성화되었다빚을내는 게시 5. 조골 칼슘 매트릭스 증착 분석 먼저, 배지를 흡인을 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 문화를 정착, DPBS로 단층을 세척 한 다음 지시를 제조에있어서, 알리자린 레드 S 염색에 의해 달성 하였다. 지방 세포 유도는이 지침을 제조에 따른 오일 레드 O 솔루션, 매체를 흡입 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 문화를 고정, 단일 층을 세척하고, 염색으로 평가 하였다. 스테인드 칼슘 예금과 석유 공포 후 광학 현미경으로 시각화 및 이미지는 나중에 참조 할 수 있도록 저장되었습니다. 이전의 출판물에서, 우리는 더 광범위 4,5 태반 유래 MSC의 분화 잠재력을 특징으로하고있다. 지방 조직은 태반 유래 MSC 5 일반적으로 덜 효율적인 동안 태반 유래 MSC의 골 형성은 <, 골수 유래 MSC와 유사하다/ SUP>. 이 이전에 태반-MSC (5) 우리가보고되어 있지만 우리는 정기적으로, 여러 가지 이유로 연골 분화를 수행하지 않습니다. 중배엽 분화 능력은 MSC의 특성을 정의하면서 먼저, 상기 치료 효과가 분비 분비물 MSC (26)로부터 유래 될 가능성이 특히 여기서, 이차적 23-25 쉽다. Dominici는 등. 인간의 성인 골수 유래 MSC 16의 임상 적 생산을위한 최소한의 기준을 제시하지만, 다른 틈새 시장이 서로 다른 고유의 특성과 분화 능력 5,13,27-32가에서 두 번째로, 최근 연구는 MSC를 나타냅니다. 실제로는 Parolini 외. 태반 유래 MSC "은 하나 이상의 중배엽"계통이 아닌 세 개의 계통 (10)으로 분화하도록 제안 하였다. 이는 유사한 통해 발생 마지막으로, 다수의 MSC 연구는 연골 분화를 제외골 형성 등의 세포 내 신호 전달 경로 (TGFβ 가족 경로) 33-35. 태반 MSC는 출발 물질의 해부학 적 위치에도 불구하고,이 배양 방법을 이용하여 모체 기원이다. 대부분의 출판물은 세포 배양 14시 태아의 융모막 수율 태아 MSC에서 분리 된 것으로 가정합니다. 우리가 이전에 5보고 그러나, 모든 문화는 빠르게 직관적으로 산모의 탈락 MSC 문화에 대해 예상되는 바와 같이 산모의 MSC에 대한 풍부한 될이 프로토콜을 사용하여 태아의 융모막에서 유래. 쉽게 확장 된 세포 집단에서 태아와 모체 세포 기여를 묘사 할 수 있었다 있도록 이러한 대표적인 결과에서 우리는 남자 아기의 태반 조직을 사용했다. 이러한 연구를 위해 우리는 자재 / 장비의 표에 나와있는 XY 생선 키트를 사용하고, 제조 업체의 지침을 따랐다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = "1"> 여기에 제공된 대표 데이터에서 문화가 산모의 탈락에서 유래했다 ~ 90 % 모체 세포 (XX)와 ~ 통로 0에서 10 % 태아 세포 (XY) (그림 6) . 통로 (2)에 의해, 모체 조직으로부터 유래 된 세포 집단은 (XX) ~ 100 % 모체 세포이었고, 태아 세포 (XY)이 탐지되었다. 이것은 모성 조직의 물리적 해부 후속 문화의 모체 세포의 농축되었다 제안합니다. 그러나, 태아 융모 융모막 판 유래 배양에서 배양 결과를 고려하는 것이 중요하다. 통로 0에서 태아의 융모막 융모 융모막 두 판 파생 된 문화 타겟 절개 태아 세포 (그림 6)에 대한 풍부한 것을 나타내는 ~ 85 % XY, 또는 태아 기원했다. 통로 0에서 두 문화 ~ 15 % 모체 세포 (XX) 오염 물질이 포함되어 있습니다. 놀랍게도, 통로 (2)에서 모두 태아 배양 ~ 100 % 모체 세포 (XX), 태아 세포 (XY)로 채워했다더 이상 검출되지 않았다. XY의 FISH 분석은 모체 세포 (XX 염색체가) 신속하고 지속적으로 인수 문화 태아의 융모 조직에서 파생 된 것을 알 수있다. 이것은 종종 5를 간과되는 중요한 문화의 관측이다. 이 DMEM는 태아 유래 인구를 지원하도록 설계 추가 요소없이 사용이 10 % FBS와 보충 할 때 모체 세포가 빠르게 모든 문화를 채우는 매우 중요한 관찰을 보여줍니다 때문에이 분석의 세부 사항은이 프로토콜에 포함되어 있습니다. 그림 1 :. 태반 MSC 분리 절차의 개요 (1 단계) 태반 해부학와 함께 자신의 방향을. (2 단계) 수동으로 탈락, 융모막 융모 또는 가위를 사용하여 융모 판 중 하나에서 조직의 10g을 해부하다. (단계 3) t 말하다그는 가위 나 메스와 미세 조각으로 탈락, 융모막 융모 또는 융모 판 조직의 일부를 해부. (4 단계) 디스 파제와 콜라게나 I.에서 1 ~ 2 시간의 소화를 통해 미세 조각에서 세포를 해방 (단계 5) 펄스를 원심 분리 및 / 또는 셀 스트레이너를 통해 세척하여 섬유 조직으로부터 세포를 분리. 수집 및 배지에서 세포를 재현 탁하고 배양 플라스크에 넣고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 중간 엽 기질 세포 (MSC)는 플라스틱 준수 및 생존과 배양 배지에서 증식 능력에 대한 자신의 성향에 따라 선택됩니다. 마지막으로, 결과 섹션에서 팽창 MSC 특성화 될 수 있고, 미래의 실험에 사용하기 위해 저장된다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = "1"> 그림 2 :.이 절차에 고립 된 인간의 용어 태반 조직의 해부학 수확하는 첫 번째 조직은 산모의 탈락이다. 탈락 그것이 (탈락 녹색 마커에 의해 식별된다) 자궁벽에서 흘린 후 태반의 표면에 얇은 층으로 남아있는 조직이다. 태반의 내부에서 수확됩니다 두 번째 조직은 태아의 융모막 융모 (파란색 마커)입니다. 수확하는 세 번째 조직 (참조 36에서 적응) 태아의 융모 판 (빨간색 마커)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : 48 시간 격리 다시 후 문화의 형태학조직 파편을 이동. (A) 배양 상등액의 모양 부스러기를 세척하기 전에 태반 기증자 사이에 실질적으로 변할 수있다. 예 배양 물 1 및 2는이 변화를 보여준다. 이 두 아이솔레이션을 동시에 수행하지만, 두 개의 서로 다른 태반에서 있었다. 후속 팽창 결과는 일반적으로 일치하는 실시 예 3에 나타낸 바와 같이 한번 세정 배양 적혈구 및 조직 파편이 명백 할 것이다. 48 시간의 미디어 교환하기 (B)는 단지 몇 세포가 플라스크에 부착 될 것이다. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4 :. 시간이 지남에 MSC 문화의 형태학 (A) 분리 후 7 일, 작은 F비 MSC 세포는 원형 또는 느슨하게 연결된 세포와 같은 존재한다하더라도 ibroblastic MSC 식민지 볼 수 있습니다. (B) 분리 후 십삼일, 섬유 모세포 MSC 식민지가 크고 자주 MSC의 단층이 합류 및 통로 준비입니다. 통로 (2) 이후부터 (C)는 MSC의 단층이 합류 특성 소용돌이 모양의 형태를 개발합니다. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 :. 유동 세포 계측법 및 중배엽 분화에 의해 MSC의 특성 (가) 태반의 융모막 융모 유래 MSC는 유동 세포 계측법 분석에 의해 고전 MSC 마커 프로파일을 표시이 세포 표면 마커, EXPRES 있지만,시온은 인간 MSC의 모든 종류의 유사합니다. 각 히스토그램은 y 축 (최대의 %)에 상기 정규화 된 셀 계수 대 신호 강도 (X 축)을 나타낸다. 설정이 대표 데이터에서 세포는 조혈 마커 CD45 및 CD34 및 HLA-DR에 대한 CD73, CD105과 CD44 양성 및 음성이었다. (B) 태반 MSC는 일반적으로 단 (C)이 지방 세포 분화가 골수 유래 MSC보다 덜 효율적일 수 있으며, 강력한 골 형성 분화를 겪는다. 자막 B와 C의 이미지가 40 배 배율로 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6 : 태반 MSC는 출발 물질의 해부학 적 위치에도 불구하고, 문화의이 방법을 사용하여 원점에서 산모 있습니다.플롯은 태아 (남성 XY)와 어머니의 모든 제 2 통로에서 탈락, 융모막 융모와 융모 판 조직에서 분리 태반 MSC 문화의 (여성 XX) 세포 성분의 정량을 보여줍니다. 산모 세포 (XX)는 신속하고 재현성 태아의 융모 조직에서 파생 된 문화를 정복. 태아 = 남성 = 개별 세포에서 발견 XY 염색체, 개별 셀에서 검출 된 산모 = 여성 = XX 염색체. 여기에 제시된 데이터는 XY의 물고기를 염색하고 각 데이터 포인트 계산 100 셀의 최소, 남자 아기에서 N = 3 독립적 인 기증자 태반에서였다. 바는 평균을 나타내며, 오차 막대가 하나의 표준 편차를 반영한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
태반은 태아 또는 모체 MSC 22을 분리 할 수있는 것을 말하고, 물리적으로 대형 기관이다. 여기서, 우리는 구체적으로 탈락 (임산부), 융모막 융모 (태아)와 융모 판 (태아) 조직 (2.2-2.4 단계) 해부하는 방법에 대한 태반 해부학과 명령의 자세한 개요를 제공했다. 다음으로, 우리는 이들 세 조직 (2.5-2.6 단계) 각각으로부터 MSC 분리 가능 강력한 프로토콜을 설명했다. 태반 MSC 확장은 효율적이고 배양 골수 – 유래 MSC 배양 (도 3 및도 4)과 유사한 나타난다. 지방 세포 분화는 일반적으로 (그림 5C) 5 비효율적 동안 골 형성 분화는 (그림 5B) 신뢰할 수있다.
분야에 많은 신규 이민자는 태아의 융모막 융모 또는 융모 판 조직에서 파생 된 문화가 태아 MSC에 대한 풍부한 될 것으로 추정됩니다. 그러나, 우리의 손에 철탈 세포 농축는 일시적인 경우 등 DMEM-LG + 표준 MSC 확장 FBS 배지 5를 이용 10 %. 여기에서 우리는 남자 아기에서 파생 된 태반 조직을 사용하는 대표적인 결과를 제공합니다. 모체 세포 XX 염색체를 갖는 것으로 식별하는 동안 수형 아기의 태반 조직을 사용하여 태아 세포는 용이하게 특정 가능 XY 염색체를 갖는 것으로한다.도 6은 대표적인 배양 XY 물고기 결과를 나타낸다. 태아 MSC (XY)이 태아 융모 또는 융모 판 조직 유래 초기 배양에서 (최대 80 %) 농축되어 있지만,이 같은 문화 신속 처음 두 통로 위에 (~ 100 %) 모체 그래피 (XX) MSC 뽑힌되고 . 표준 매체에서, DMEM-LG + 10 % FBS, 태아 조직 문화의 태아 유래 세포를 outcompete 오염 몇 산모의 유래 MSC로 구성.
이 프로토콜에 설명 된 중요한 단계는 태반 해부학 어디 태아에서 감사입니다산모 조직을 가장 효과적으로 수확 할 수있다. 대표적인 결과 섹션에 설명 된대로, 태아 조직의 박리는 태아 유래 MSC에 대한 과도 농축을 가능하게 않습니다. 확장 배지 제형 개선은 특정 외인성 성장 인자 배지 보충으로 태아 유래 MSC 인구의 선택적 확장을 허용하고, (우리 그룹은 이러한 매체 제형을 개발하고있다) 태아보다는 모체 세포 충실 셀 제품을 제조한다. 태아 MSC가 큰 혈관 및 등가 모체 MSC 인구 (37)보다 면역 억제 특성을 갖는 것으로 추정 된대로 태아 MSC 집단의 제조는 다수의 장점을 가질 수있다.
상술 분리 각 프로토콜에서는 조직의 약 10g을 사용 하였다. 전체 태반은 일반적으로 500~750g이며, 이전의 연구에서 우리는 증명이 자동화 된 조직 다이제스트 및 셀 확장 생물 반응기 시저를 통해이 가능해야 esses 번의 태반 4에서 7,000 세포 임상 용량을 제조한다. 이 숫자에 관계없이 (태아 나 산모) MSC 기원 태반 유래 동종 MSC 치료에 MSC,이 방법의 중요성의 잠재적 인 적합성을 강조 표시합니다. 치료 적 관점에서, 사용자가 휴대 제품 신뢰성이 셀 제품을 제조 할 수있는 능력의 완전한 이해하는 것이 가장 중요하다. 우리는 우리의 비디오, 태반 해부학을 이해 태반에서 MSC를 분리, 그들의 문화의 가능성이 태아 나 모체 세포 조성물을 예상하는 연구자 도움이되기를 바랍니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RP는 국립 보건 의료 연구위원회 (NHMRC) 박사후 연수 원정대에 의해 지원되었다. VS는 대학 퀸즐랜드 국제 대학원 학생의 장학금으로 지원되었다. MRD는 NHMRC 및 내부 휠 호주에 의해 지원되었다.
우리는 환자의 동의 및 샘플 컬렉션 지원에 대한 임상 간호 직원을 감사드립니다. 우리는 산부인과에서 통찰력 토론, 태아 – 태반 개발 및 태반 해부학에 대한 교수 Nickolas 피스크 교수 케리 앳킨슨 박사 로한 Lourie 감사합니다.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
| DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
| Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
| Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables: | |||
| 50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
| petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
| Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
| 175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
| 5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | |||
| tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Sterile scissors and tweezers | |||
| Tube racks | |||
| Pipette-boy or equivalent | |||
| Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
| rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
| personal protective equipment | |||
| cleaning solutions (suitable for blood) | |||
| waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
| Reagents for MSC characterization | |||
| Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
| CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
| CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
| CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
| CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
| CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
| HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
| CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
| CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
| CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
| Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
| Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| insulin | Sigma | I2643 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
| Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
| XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
| XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |
Referencias
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
- Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
- Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21, 216-225 (2014).
- Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
- Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
- Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
- Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
- Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. . Pathology of the Human Placenta. , (2012).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. . The developing human: clinically oriented embryology. , (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
- Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
- Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15 (2014).
- Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
- Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
- Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9, 641-650 (1991).
- Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
- Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225 (2012).
- Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
- Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
- Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
- Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
- Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. , (2013).
- Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
- James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736 (2013).
- Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. . Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. , (2011).
- Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48 (2014).
Citar este artículo
Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue. J. Vis. Exp. (112), e54204, doi:10.3791/54204 (2016).