नवजात मस्तिष्क में वायरल कणों और फ्लोरोसेंट microbeads की Intracerebroventricular और Intravascular इंजेक्शन
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
वायरल इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन पर अध्ययन में, संक्रमण विधि महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क के लिए दो मुख्य मार्गों संक्रामक के पहले hematogenous मार्ग है, जो endothelial कोशिकाओं और मस्तिष्क के pericytes के संक्रमण शामिल है। दूसरी Intracerebroventricular (आईसीवी) मार्ग है। एक बार जब केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर, वायरस subarachnoid अंतरिक्ष, तानिका, और मस्तिष्कमेरु द्रव के माध्यम से रंजित जाल में फैल सकता है। प्रयोगात्मक मॉडल में, सीएनएस वायरल वितरण के शुरुआती दौर में अच्छी तरह से विशेषता नहीं कर रहे हैं, और यह स्पष्ट नहीं है कि केवल कुछ कोशिकाओं शुरू संक्रमित हैं। यहाँ, हम संक्रमण के तीव्र चरण के दौरान cytomegalovirus (सीएमवी) कणों के वितरण का विश्लेषण किया है, प्राथमिक viremia करार दिया, नवजात माउस मस्तिष्क में आईसीवी या intravascular (चतुर्थ) इंजेक्शन के बाद। आईसीवी इंजेक्शन मॉडल में, murine सीएमवी (इन क्षेत्रों में एमसीएमवी) या फ्लोरोसेंट microbeads के 5 μl midpoi में पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया गयाNT कान और आंख एक 27 जी सुई के साथ एक 10 μl सिरिंज का उपयोग कर के बीच। चतुर्थ इंजेक्शन मॉडल में, एक 35 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का इस्तेमाल किया गया था। एक transilluminator सतही लौकिक (चेहरे) नवजात माउस की नस कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम सतही लौकिक नस में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी या फ्लोरोसेंट microbeads के 50 μl संचार। दिमाग अलग अलग समय बिंदुओं के बाद इंजेक्शन पर काटा गया। इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम सीटू संकरण विधि में उपयोग करते हुए पाया गया। फ्लोरोसेंट microbeads या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन पुनः संयोजक इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों व्यक्त फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया। इन तकनीकों में इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन जांच करने के लिए कई अन्य रोगाणुओं के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
जब वायरल इन्सेफेलाइटिस का अध्ययन, वायरल कणों की प्रारंभिक वितरण रोग रोगजनन समझने के लिए और मस्तिष्क में वायरल लक्ष्यों की पहचान करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अधिकांश वायरस, 20 से 300 एनएम से आकार में सीमा हालांकि Pandoravirus आकार 1 में अधिक से अधिक 700 एनएम है। संक्रमण की तीव्र चरण में वायरल कणों के वितरण के कणों के आकार, सेलुलर रिसेप्टर्स के वितरण, या वायरस के लिए सेलुलर रिसेप्टर्स की आत्मीयता पर निर्भर हो सकता है। पशु मॉडल, Intracerebroventricular (आईसीवी), intraperitoneal, प्रत्यक्ष अपरा, और नसों (चतुर्थ) के संक्रमण वायरल इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है में। वायरस से आईसीवी टीका अक्सर चूहों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के संक्रमण को स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग विशेष रूप से अध्ययन periventricular क्षेत्रों में कोशिकाओं की और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), simila के साथ सीधे संपर्क में मस्तिष्क के क्षेत्रों में व्यापक संक्रमण की रिपोर्टवायरल ventriculoencephalitis के प्रभाव के लिए आर। एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) कणों के छोटे आकार (20 - व्यास में 25 एनएम) आईसीवी संक्रमण के 2-4 में मस्तिष्क भर में उनके प्रचार-प्रसार की सुविधा। इंट्रापेरिटोनियल 5, प्रत्यक्ष अपरा 6, और चतुर्थ इंजेक्शन 7 hematogenic प्रणालीगत प्रशासन प्रतिनिधित्व करते हैं। रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के माध्यम से वायरल कणों की पैठ उन्हें नवजात मस्तिष्क के पैरेन्काइमा तक पहुंचने के लिए, फैलाना microglial पिंड 8,9 का प्रतिनिधित्व करने की अनुमति देता है।
साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) एक आम वायरस है कि दाद वायरस परिवार से संबंध रखता है। संयुक्त राज्य अमेरिका में 50% – लोगों के 80% से 40 सीएमवी संक्रमण को शायद ही कभी हानिकारक हैं लेकिन immunocompromised रोगियों और भ्रूण में रोगों का कारण बन सकती उम्र से सीएमवी संक्रमण पड़ा है। सभी प्रसव के 0.2% – 2%, सीएमवी 10 के साथ पैदा होते हैं ऐसे microcephaly, periventricular कड़ा हो जाना, अनुमस्तिष्क hypoplasia, माइकर के रूप में गंभीर लक्षण है, जिसके परिणामस्वरूपआफ़्टलमीय, और ऑप्टिक तंत्रिका शोष 11,12। इसके अलावा, मानसिक मंदता, sensorineural सुनवाई हानि, दृश्य दोष, जब्ती, और मिर्गी गैर-प्राणघातक रूप से सीएमवी से संक्रमित शिशुओं 13,14 के बारे में 10% में होते हैं। सीएनएस में शिथिलता सीएमवी जन्मजात विसंगति का सबसे आम लक्षण लक्षण है। अधिक बच्चों को स्थायी रूप से डाउन सिंड्रोम, भ्रूण शराब सिंड्रोम, या द्विमेरुता 15 द्वारा की तुलना में जन्मजात सीएमवी द्वारा प्रत्येक वर्ष अक्षम हैं। वहाँ एक सुरक्षित और प्रभावी वैक्सीन की जरूरत के लिए बुला सीएमवी के खिलाफ कोई टीकाकरण वर्तमान में उपलब्ध हैं। संक्रमण का जल्द से जल्द चरण में उनकी रिसेप्टर्स के साथ सीएमवी कणों की बातचीत का अध्ययन टीकाकरण के प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
Ventriculoencephalitis और फैलाना microglial पिंड दो सीएमवी की मुख्य विशेषताओं रोग इन्सेफेलाइटिस 16 हैं। यह अनिश्चित हो गया है कि कैसे सीएमवी कणों (150 – 300 एनएम) संक्रमण एक की तीव्र चरण में मस्तिष्क के माध्यम से फैलएन डी कैसे सेलुलर रिसेप्टर्स के वितरण और वायरस के लिए उनके संबंध वायरल प्रसार के लिए योगदान करते हैं। कावासाकी एट अल। आईसीवी और कणों और उनके रिसेप्टर्स (β1 इंटीग्रिन) संक्रमण की जल्द से जल्द चरण में के वितरण के नजरिए से चतुर्थ में संक्रमण का मूल्यांकन किया है। हमने पाया है कि सीएमवी कणों और β1 इंटीग्रिन की अभिव्यक्ति के प्रचार-प्रसार में अच्छी तरह से दोनों आईसीवी और चतुर्थ में संक्रमण 8 में संक्रमण की जल्द से जल्द चरण में सहसंबद्ध होते हैं। आईसीवी संक्रमण ventriculoencephalitis का एक मॉडल है और चतुर्थ संक्रमण फैलाना microglial पिंड का एक मॉडल है। वायरल या फ्लोरोसेंट कणों की गतिशीलता के अध्ययन के कण आकार, सेलुलर रिसेप्टर्स के साथ वायरल बातचीत, और मस्तिष्क में बीबीबी प्रवेश के तंत्र के प्रभाव पर उपयोगी जानकारी देना होगा। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सीएनएस में किसी भी वायरल संक्रमण और वायरल वेक्टर जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पशु मॉडल, आईसीवी, intraperitoneal, प्रत्यक्ष अपरा, और चतुर्थ के संक्रमण में वायरल इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम प्रक्रियाओं की सादगी और लक्ष्य क्षेत्र में कणों के प्रत्यक्?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
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