Определение биопленки инициации на инфицированные вирусом клетки с помощью бактерий и грибов
Summary
A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.
Abstract
Изучение Полимикробные взаимодействий через таксономических царств, которые включают грибы, бактерии и вирусы не были ранее рассмотрены в отношении того, как вирусные члены микробиомом влияют на последующие микробные взаимодействия с этими инфицированных вирусом клеток-хозяев. Сожительства вируса с бактериями и грибами, главным образом присутствует на поверхности слизистой оболочки полости рта и половых путей. Слизистые клетки, особенно с постоянными хроническими или стойкими латентных вирусных инфекций, может оказать существенное влияние на членов микробиомом посредством вируса изменения в количестве и типе рецепторов, выраженных. Внесение изменений в архитектуре клетки – хозяина мембраны приведет к измененному способности последующих членов нормальной флоры и условно – патогенных микроорганизмов , чтобы инициировать первый шаг в формировании биопленки, т.е. присоединения. Это исследование описывает способ количественного и визуального изучения эффекта HSV на инициирование biofilформирование м (присоединение) из S. стафилококк и C. Albicans.
Introduction
Человек микробиомом включает в себя разнообразные организмы из различных таксономических царств, которые разделяют географические регионы в организме. Приверженность к поверхности клеток является важным первым шагом в формировании биопленки, которая является частью процесса микробиомом колонизации. Включенный в микробиомом могут быть вирусы, которые вызывают хронические и хронические инфекции. Хроническая инфекция клеток этими вирусами , может привести к изменению в мнимым доступности рецепторов. 1,2 Кроме того, проникновение в клетку путем внутриклеточных патогенов также может влиять на хост текучесть мембран / гидрофобность , которая в свою очередь может изменить прикрепление других членов микробиомом, в том числе бактерии и грибы , Для того, чтобы понять взаимодействия, которые могут возникнуть между этими несколькими патогенными микроорганизмами, которые совместно локализуются в одних и тех же географических регионах человеческого организма, мы должны иметь возможность изучать взаимодействие патогенных микроорганизмов, которые представляют спектр таксономических царств, присутствующих на поверхности слизистых оболочек.
т "> The Герпесвиридае семейство микробов , присутствующих в 100% людей в качестве постоянных членов микробиомом 3,4. Кроме того , они могут также быть постоянно пролил как в присутствии и в отсутствие симптомов. В частности, вируса простого герпеса-1 и вируса простого герпеса-2 (ВПГ-1 и ВПГ-2, соответственно) являются постоянными членами микробиомом в oronasopharynx и половых путей. в иммунокомпетентных лиц, как ВПГ-1 и ВПГ-2 вызывают гингивостоматит, а также генитальный герпес 5-8. на этих участках, ВПГ вызывает латентную инфекцию характеризуется хроническим персистирующим бессимптомным вирусовыделение 9. Вступление HSV в клетках приводит к изменениям в поверхностной экспрессии nectins, гепарансульфата, липидных плотах и герпесвирусов ввода посредника / некроза опухоли рецептор фактора (HVEM / TNFR) 10-25. Эти потенциально представляют собой общие рецепторы для некоторых бактерий и грибков, например , золотистого стафилококка и C. Albicans, которые в то время как условно – патогенными микроорганизмами,могут также находиться в качестве членов слизистого микробиомом из oronasopharynx 26,27. В oronasopharynx С. стафилококк и C. Albicans занимают две различные участки колонизации. В хостов с естественными зубами, слизистой оболочки полости рта разделяют HSV-1 и С. Albicans, в то время как передние носовые ноздри заняты S. стафилококк 28. Однако, несмотря на в пробирке выводы , что С. стафилококк прилипает ко рту эпителиальных клеток, 29,30 S. стафилококк нечасто изолирована от полости рта образцов при нормальной ткани присутствует 29,30. Мало что известно о половых путях со-колонизацию нишах , помимо клинических данных , что С. стафилококк связано с аэробного вагинита, характеризующийся воспалением половых органов, выделения и диспареунии, в то время как C. Albicans производит повреждения слизистой оболочки , аналогичные тому , что наблюдается в ротовой полости 31-35. Таким образом, хотя эти члены устного и генитального microbiекоторые крест таксономические царства мало известно об их взаимодействии , как это влияет на их способности инициировать образование биопленки за счет присоединения к поверхности клетки – хозяина 5. Этот протокол был эффективно применен для определения функциональных последствий совместного колонизации / инфекции.Protocol
1. HSV Штаммы и регулировать Примечание: Рекомбинантный нерасплывающихся ВПГ-1 (KOS) gL86 и HSV-2 (нокаутов) 333gJ – с репортером активности бета-галактозидазы , используемой были предоставлены В. Twiari 36,37. Использование вируса из одной партии и хранят при -80 ° С в соотношении 1: 1 ?…
Representative Results
Уровень надежности данных , полученных из системы , описанной в настоящем докладе показано на рисунке 2 аф 38. С помощью этой системы модуляции стафилококковой и грибковой взаимодействия с инфицированных вирусом клеток и их влияние на соблюдение друг др?…
Discussion
На данный момент информация не доступна на сложных взаимодействий между постоянными до полупостоянных членов принимающего микробиомом , которые пересекают несколько таксономических доменов, т.е. прокариот, эукариот и вирусные. Поэтому мы разработали роман в пробирке модель…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).
Materials
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50mg/ml | Sigma | 1397 | 50µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1XPBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100X15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150X15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100×13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
Referencias
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors – signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- . National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology – an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
Citar este artículo
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).