גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.
המפרט של תאי hemogenic האנדותל מן האנדותל של כלי דם עוברי מתרחש בתקופות התפתחותיות קצרות בתוך רקמות שונות, והוא חיוני עבור הופעתה של HSPC הסופי מן צק חלמון murine הנוסף העוברי, שליה, כלי טבור, ואת עוברי האאורטה-בלוטת מין-הכליה ( באזור AGM). האופי החולף והגודל קטן של אוכלוסיית תא זה הופך הבידוד לשחזור שלה כימות זהירה ויישומים ניסיוניים קשה מבחינה טכנית. הקמנו תא קרינת מיון מופעל (FACS) פרוטוקול מבוסס לבידוד בו זמני של תאי hemogenic האנדותל HSPC בזמנים הדורים לשיאם צק החלמון ואת AGM. אנו מדגימים שיטות לנתיחה של שק החלמון ורקמות AGM מעוברים העכבר, ואנחנו מציגים תנאים לעיכול רקמת אופטימיזציה נטיה נוגדן להישרדות התא מקסימלי לפני זיהוי ואחזור באמצעות FACS. נציג FACS anaמגרשי תמוגה מוצגים המזהים את תא hemogenic האנדותל פנוטיפים HSPC, ולתאר assay מבוסס methylcellulose להערכת הפוטנציאל להרכיב בדמם ברמה משובטת.
מערכת דם פונקציונלית מחייבת פיתוח המקביל של כלי דם ותאי דם. בשלבים המוקדמים של פיתוח דם (hematopoiesis הפרימיטיבי), מקורם של erythroblasts נשאר התווכח 1 במרץ. לעומת זאת, בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות תאי הדם (hematopoiesis סופי), זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי HSPC רב השושלת להתעורר מתאי אנדותל כלי הדם מיוחדים לרכוש דם להרכיב פוטנציאל (תאי אנדותל hemogenic) בתוך שק חלמון, השליה, וכן AGM 2-5, כמו גם את vitelline וכלי טבור, את endocardium העוברי 6, וראש כלי דם 7. המפרט של תאי hemogenic אנדותל בתוך רקמות הברורות אלה מתרחש בשלבים מסוימים של פיתוח; למשל, בתוך שק החלמון ב ~ E8.25 ובתוך AGM ב ~ E10 8-12. עם זאת, גם במהלך חלונות התפתחותיים ספציפיים אלה, האוכלוסייה של אנדו hemogenicתאים thelial מייצג חלק קטן של כל תאי האנדותל (1 – 3% שק החלמון ותאי האנדותל AGM) 11,12. תהליך "מפרט" hemogenic אנדותל תא הוא קריטי עבור בעכברים, כמו גם אדם, hematopoiesis. תאים Hematopoietic הוכחו ניצן מן האנדותל של כלי שק חלמון לבין אבי העורקים בעוברים אנושיים 13, וכמה מעבדות הוכיחו כי ייצור תאי דם מתאי גזע פלוריפוטנטיים האדם דורש תא האנדותל 14-16 ביניים. לכן, הגדיר את הפנוטיפ של תאים בעכברי hemogenic אנדותל והבנת אירועים המולקולריים להוביל להתפתחותם מודל זה חי אמור להקל במרדף אחר טכנולוגיות במבחנה עבור דור של תאי hemogenic אנדותל מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם. בתורו, פיתוח העתידי של גישה עבור דור בקנה מידה גדולה של סוגי תאי דם בדיל מן HSPC רב שושלת – עצמם דרעיved מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות תא hemogenic אנדותל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ביניים – יצטרך פוטנציאל טיפולי מדהים עבור המטולוגיות, האונקולוגיים ורפואה רגנרטיבית. לקראת מטרה זו, הגדרנו את הפנוטיפ של תאי hemogenic אנדותל, ברמה משובטת, בתוך החלמון murine צק 11 ו AGM 12, שני אתרים גדולים של ייצור HSPC הסופי במהלך embryogenesis. כמו HSPC בתוך מח עצם בוגר 17, תאי אנדותל ומאפיין בזרימה לצבוע Hoechst תערוכת HSPC hemogenic עובריים ולכן מופיע בתוך "האוכלוסייה בצד" (SP) של תאים על מגרש FACS 5,11,12 (כפי שמוצג באיור 3). בנוסף, אנו גם הראו כי תאי אנדותל hemogenic להביע סמנים של שני אנדותל ותאי גזע (Flk1 ו cKit, בהתאמה), אך אינם מבטאים את סמן השושלת hematopoietic, CD45 5,11,12. לכן, תאים hemogenic האנדותל יכול להיות הזיהויified ומבודדת על ידי FACS כמו Flk1 + / cKit + / תאים CD45- SP, ואנחנו הראו כי תאים אלה להצמיח HSPC הכלול בתוך שבריר Flk1- / cKit + / CD45 + SP של שק החלמון ותאי AGM 5,11,12. תאי אנדותל Hemogenic ו HSPC ניתן לזהות ומבודד מן שק החלמון או רקמות AGM שנקטפו משני עוברים מורדמים טרי, או מעוברים בתרבית למשך עד 48 שעות בתרבות העובר vivo לשעבר (כמתואר באיור 1). Ex vivo התרבות מאפשר סלקטיבית טיפול מקדים של עוברים פרטניים עם סוכנים תרופתיים, ומאפשר גם ביטוי חולף של transgenes הרצוי (כלומר, על ידי תמרת lentiviral). זיהוי FACS של תאי אנדותל hemogenic ו HSPC מהפעלת השיטה המתוארת במסמך זה יכול לשמש כמדד כמותי של פיתוח hematopoietic סופי במודלים של עכברים מניפולציה גנטית; גם ניתן לאחזר את התאים עבור היישומים הבאים הניסיונות, כוללים-FO דםמבחני rming, ניתוח ביטוי, והשתלות.
בנושאים בעלי חיים: שימושי שיקולים אתיים
גוף של ספרות גוברת הקים את תרומתו החשובה של תאי אנדותל hemogenic להיווצרות HSPC בשלב hematopoiesis הסופי של התפתחות עוברית. עם זאת, גם במצב רגיל וגם אותות המקדמים מפרט של תת-אוכלוסייה של תאי אנדותל כלפי גורל hemogenic להישאר ממעטים להבין, ולכן לא ניתן חיקה עדיין בסביבה חוץ גופית. אכן, הטכניקות המתוארות במאמר זה נמצאים כעת בשימוש על ידי המעבדה שלנו וקבוצות אחרות כדי לשפר את ההבנה של תחום הפיתוח hematovascular, שיאפשר גישה עבור vivo לשעבר מפרט תא hemogenic האנדותל וייצור HSPC אולי יום אחד להיות מפותח. עד אז, לעומת זאת, בתחום נשאר תלוי רקמות עיקריות מן wild-type (וגןעוברי עכברים מהונדסים tically) להשיג שצוינו תאי hemogenic האנדותל HSPC למחקר נוסף. תאי אנדותל Hemogenic ו HSPC ניתן לזהות באופן אמין מבודד E8.5 או (10 – 12 זוגות somite) שק חלמון או E10.5 (35 – 40 זוגות somite) AGM 11,12. בשל המחסור היחסי של תאי אנדותל hemogenic (בדרך כלל מייצג 1 – 3% של תאים הכולל אנדותל 11,12 בתוך רקמות אלה) וריכוז רקמות מן מרובים (~ 8 – 10) להמלטה לתוך מדגם יחיד מומלץ מאוד כדי להשיג מספיק תאים לניסויים הבאים. אימות שתאי hemogenic האנדותל HSPC זוהו בהצלחה ומבודדת ניתן להשיג על ידי התרבות של תאים לאחזר בתנאי להשרות התמיינות hematopoietic. בתנאים אלה, תאי אנדותל hemogenic ו HSPC יפגינו בידול hematopoietic רב השושלת, וכתוצאה מכך הופעתו של מושבות המכילות eryאבות throid (BFU-E), גרנולוציט ואת אבות מקרופאג (CFU-GM), ו גרנולוציט, כדורית, מקרופאג, מושבות אבי megakaryocyte (-GEMM CFU).
נותרו שאלות רבות ללא מענה בתחום פיתוח hematovascular – תחום הוא עדיין בחיתוליו בשל הקשיים הטכניים הטמון בלימוד אוכלוסיות תאים חולפים וקטנות העולות רק במהלך חלון התפתחותית מסוימות. הטכניקות המתוארות לעיל לשפר בחלק גדול מהקשיים הללו בכך שהוא מאפשר בידוד של תאים בודדים אפילו מתא hemogenic אנדותל ואוכלוסיות HSPC ברקמות עובריות בנקודות זמן התפתחותיים קריטיות באמצעות חומרים כימיים וציוד כי הם בדרך כלל זמינים ברוב המעבדות. הפרוטוקול שלנו גם מאפשר בידוד מקביל של שברי תא האנדותל הלא hemogenic מן י"ש ו AGM, אשר ניתן להשתמש בם עבור ניתוחים פרטיים, או כפי שולט עבור שבריר תא hemogenic האנדותל ניתוחים שלאחר מכן.
נקודת מפתח הבידוד של תאי אנדותל hemogenic בשיטה מבוסס FACS ססגוניות זה שיתוף ספקטרלי המתאיםmpensation וציור מדויק של שערים יחיד צבע. ככזה, הוא מומלץ מאוד שולט בלא כתם יחיד צבע להיכלל כל ריצות ניסיון, ושהם – יחד עם דגימות מטופלים עם נוגדני ביקורת שווה אלוטיפ – לשמש בתחילה להקים פיצוי ספקטרלי ראוי וציור השערים. עם זאת, הלא ספציפי המכתים הוא מינימאלי על ידי פרוטוקול זה, ובכך שולט בלא כתם יחיד צבע מספיק בדיקה שיגרתית של שערים פעם הגדרות סדרן FACS ממוטבים.
לא מדויק נמשכים שערי SP הם תופעה מדאיגה במיוחד עם הגישה המתוארת בדוח זה. מחקרים קודמים הראו כי תאי גזע מולטיפוטנטיים להפגין בזרימת מועדף של Hoechst 17 אדום, ויצרו את הבסיס הפיזיולוגי עבור הופעתם SP ידי FACS. הראינו תאי אנדותל hemogenic כי ו HSPC נמצא באופן דומה בתוך שבריר תא SP 5,11. סמים כגון תעלות סידן בhibitor Verapamil לחסום התנהגות בזרימת לצבוע Hoechst זה בתאים SP באמצעות חסימה של מגוון של מובילי ההתנגדות multidrug הטרנסממברני. בשנת תאי גזע אבות היווצרות הדם, זה קורה בעיקר דרך טרנספורטר ABCG2 / BCRP1 24. בדרך כלל verapamil גורמים> 50% חסימה של SP, עם זאת, מידת הכולל של בזרימת Hoechst והסתימה לאחר מכן על ידי Verapamil לראות הוכחה להיות מושפעות מעיתוי התפתחותית, ככל הנראה בשל שינוי ביטוי של סוגי טרנספורטר המרובה multidrug עמידים עם דיפרנציאל Hoechst יכולת בזרימה, ורגישות Verapamil 5. לכן, מומלץ מאוד כי Verapamil שטופל Hoechst מוכתם שלילי מלא להיכלל standardly כדי להבטיח gating SP הנכון: אם שער SP מופנה כראוי, הפחתה נכרתה את מספר תאי SP צריכה להתגלות בדגימות מוכתמות Hoechst ב בנוכחות Verapamil.
הראינו בעבר כי מסודרתאים SP מ שק החלמון murine E9.5 יש ~ 80 – 90 היכולת לקפל יותר לייצר HSPC בתרבות hematopoietic מבוססי methylcellulose כשמשווים מספר תואם של unfractionated E9.5, הלא Hoechst מוכתם י"ש רקמות תאים 5 כולו. אפיון נוסף של SP הוכיח כי שק החלמון בעכברים במהלך hematopoietic מוקדם ופיתוח כלי הדם ב E8.0, יש ביטוי ניכר של VE-cadherin ו FLK-1, אבל ביטוי נמוכה של גזע (c-Kit) וסמנים hematopoietic (CD45). לפיכך, בשעה timepoint התפתחותי זה, בראשיתי (לא hemogenic) EC, המוגדר FLK-1 + / CD31 + / CD45- הלא SP תאים שולטים. משמרות פרופיל ביטוי זה כמו ביטוי סמן אנדותל פוחתת CD45 ועליות ביטוי c-Kit, בד בבד עם יכולת הגדלת ליצור HSPC במבחנה בין E9.5 ו -5 E11.5. הדבר מצביע על פעילות hematopoietic של רקמות י"ש מוכל בתוך SP, נהיה ברור ביותר בין E9.5 ואת E11.5, ו occurring דרך הפסד מתוזמן של מאפיינים האנדותל רכישה הדרגתית של יכולת hematopoietic. ככזה, ביטוי של מובילי ההתנגדות multidrug שיוצרים את הפנוטיפ SP מהווים סמן פנוטיפי חשוב של האנדותל hemogenic 5; למעשה, תאים שאינם SP מן AGM אינם מציגים דם יוצרי 12 פוטנציאליים. לכן, בידוד מוצלח של SP באמצעות מכתים Hoechst הוא י"ש ו AGM מבטיח כי תאים ימוינו מהתא לתא גזע hematopoietic של רקמות נתונות, מכתים הנוגדן הבא של תאים בתוך שבריר זה יאפשר אפליה של hemogenic (FLK -1 + / c-Kit + / CD45-) לעומת HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) אוכלוסיות 5,11,12. יתר על כן, זה כבר ציין בעבר כי CD41 + תאים בתוך SP של צק חלמון ורקמות AGM מסוגלים היווצרות מושבה רבה שושלת בתרבות methylcellulose המבוססת 11,12. אנו מגדירים תאי אנדותל hemogenic כמו Flk1 + c-kit + תא CD45- SPים באמצעות CD45 כסמן המיועד של השושלת hematopoietic ולא CD41 נתון שלנו בא לידי ביטוי של Flk1 ו CD45 הוא כמעט שוללות זו 5,11. זה מאפשר בידוד טהור של תאים בתוך SP, כי יש שני האנדותל (FLK-1) גזע מאפיינים (c-Kit) דרושים האנדותל כדי מעבר hematopoietic אבל שטרם עבר את השינוי הזה, כפי שנקבע על ידי בהעדר CD45 ב אלה תאים. זה יהיה שימושי לשקול-חלוקה תת מהאוכלוסייה HSPC, המוגדר FLK-1- / c-Kit + / CD45 + / תאים SP, לתוך Csf1r + (מקרופאג רקמות) ו Csf1r- (HSC) שבר כפי שדווח לאחרונה על ידי גומז ועמיתיו 25, כמו זה יספק רזולוציה גדולה של HSPC נכון מול אוכלוסיות אבי מקרופאג רקמות, אבל זה לא אמור להשפיע על שלמות של שבריר התא hemogenic האנדותל אשר בידוד גיבשנו מאז Csf1r הוא סמן של אבות מקרופאג 26.
Hemogתאי אנדותל enic הם תת-אוכלוסייה נדירה בשני י"ש ו AGM (המהווים 1 – 3% של תאי אנדותל), ולכן אתגר גדול במחקרם של השניים היא תשואה התא מספיק עבור יישומים הבאים. פרוטוקול זה גורם בדרך כלל 70-80% של התאים הנותרים קיימא על ידי הזמן של מיון, מעין תא האנדותל hemogenic טיפוסי מרקמות ונקווה שמקורם בעוברים מרובים עשוי להניב רק כמה מאות תאים אפילו בתנאים אופטימליים עם רק 10-20% של לאחזר תאים מוטבע לתוך מושבות בייצור methylcellulose. כדי למקסם את מספר הסלולרי מיון, מומלץ מאוד כי החוקרים לנקוט בצעדים כדי להבטיח רקמות כדאיות התא לאורך כל צעד של ההליך: רקמות צריך להיות גזור במהירות ונקווה, דגימות צריך להיות כל הזמן על הקרח בכל הזדמנות אפשרית. דוגמאות צריכות להיות מוכנות טריות מייד לפני מיון FACS, מיון לתוך צינורות אוסף המכילים תוכן בסרום גבוה, או ישירות לתוך תרבות methylcellulose כמו לתארד 'לעיל. אם בעיות נמשכות כדאיות, צינורות איסוף יכולים להיות גם מראש מצופה עם סרום כדי לשפר את הישרדות תא מיון נוסף. אם תשואת תא hemogenic אנדותל נותרת נמוכה, מח עצם מבוגר או-זמינים מסחרי חרוזי fluorophore מצומדות יכול לשמש פיצוי רפאים במקום של בקרות צבע יחיד רקמת נגזרות העובריות כפי שתתוארנה בהמשך. אם תאים ממוינים מיועדים תרבות, תאי אנדותל hemogenic ו HSPC יש למיין ישירות לתוך בארות בתרבית רקמה. אם תאים ממוינים מיועדים DNA או ניתוח ביטוי גנים הקשורים RNA, hemogenic והלא hemogenic תאי האנדותל HSPC עשוי להיות מסודר ישירות לתוך צינורות אוסף המכיל חיץ מדגם תמוגה כדי להקטין את איבוד התא.
הטכניקה המתוארת התיר מוצלח (סימולטני) בידוד של בתאי האנדותל hemogenic והלא hemogenic, כמו גם HSPC ושברי תאי דם בוגרים מאותו הרקמות עובריות. גישה זו מאפשרת הרבעה נוספתy של הבסיס המולקולרי של המעברים הקריטיים המתרחשים בתאי האנדותל לייצר דם. תובנה ממחקרים התפתחותיות אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשפר את שיטות ההדורות של תאי אנדותל hemogenic אדם וצאצאי HSPC מ פלוריפוטנטיים, ואפשרות עצמית, תאי גזע לטיפול בהפרעות hematopoietic נפוצות.
The authors have nothing to disclose.
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |