Обнаружение Cortex Фрагменты Во время бактериальный прорастание спор
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
Эндоспоры метаболически покоящиеся формы бактерий, которые позволяют бактериям сохраняться в неблагоприятных условиях. Во многих спорообразующих бактерий, образование спор индуцируется недостатка питательных веществ , но этот процесс может контролироваться изменением до рН, воздействия кислорода или других напряжений 1. В то время как в их метаболически латентной форме спор, бактерий противостоять УФ – излучения, высушивание, более высокие температуры и заморозки 2. Большая часть знаний о процессе спорообразования исходит из исследований в модели организма, Сенная палочка. Процесс спорообразования начинается процесс репликации ДНК и образованием осевого 3,4 нити. Асимметричным перегородку затем делит клетку на две неравные размерных отсеков. Чем больше отсек, материнская клетка, поглотит меньший отсек, в forespore. И мать клетки и forespore координируют экспрессию генов созревать спору и материнской клетки в конечном итоге лизирует, выпустив Дормант Спора в окружающую среду 1.
Структура и состав спорово сохраняется во многих видов бактерий. Ядро Спора имеет более низкое содержание воды , чем в растительной клетке , и богата дипиколиновая кислоты (ДПА) 1,2. Во время образования спор ДПА перекачивается в активную зону споровой в обмен на воду. Вокруг ядра является внутренняя мембрана Спора , где в большинстве спорообразующих бактерий, рецепторы , которые распознают небольшие молекулы , которые стимулируют прорастание (germinants) расположены 2. Расположенный в непосредственной близости внутренней мембраны Спора представляет собой слой пептидогликана клеточной стенки. Специализированный пептидогликана слой (кора головного мозга) окружает клеточной стенки пептидогликана и состоит из многих из тех же компонентов, как клеточной стенки пептидогликана [чередующимися N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты (NAM)]. Тем не менее, примерно 50% остатков NAM в коре, были преобразованы в мурамовой-б-лактамные 5,6 </sвверх>. Во время прорастания спор, эти мурамовой-δ-лактамные остатки признаются спорово коры головного мозга литических ферментов (SCLEs), что позволяет кортекс деградировать (процесс существенный для завершения прорастание), но не клеточную стенку. Вокруг коры головного мозга является наружной мембраны и несколько слоев белков оболочки 2.
Управление процессом прорастания является критически важным для спорообразующих бактерий. Всхожесть инициируется , когда germinant рецепторы взаимодействуют с соответствующими germinants 2. Во многих спорообразующих бактерий, эти germinants являются аминокислоты, сахара, нуклеотиды, ионы или их комбинации 2. С. несговорчивый прорастание спор инициируется комбинаций определенных желчных кислот, [например, таурохолевая кислота (TA)] и аминокислот (например, глицина) 7-10. Хотя существуют различия между С. несговорчивый прорастание пути и пути изученных в других спорообразующихбактерии, такие как B. Сенная, общим для всех является абсолютным требованием , чтобы ухудшить спорами кору головного мозга , чтобы позволить вегетативные клетки расти из проросших спор 2,8. Деградация Cortex может быть достигнуто с помощью SCLEs CwlJ / SleB (как найдено в B. Сенная) или SLEC (например, во многих клостридий). гидролиз Cortex уменьшает ограничение на клеточной стенке и спорами. Это позволяет полный основной регидратации, необходимый шаг в реактивации многие из белков , необходимых для клеточного метаболизма 2.
Когда споры прорастают, недействующие изменения споровые из состояния фазы яркий в состояние фазы темноте, и этот процесс может быть измерено по изменению оптической плотности (OD) при 600 нм 11. В предыдущем докладе говорится , что большая часть этого изменения в ОД связано с выходом ДПА из спору 12. Во время нашего недавнего исследования, мы стремились сравнить сроки C. несговорчивый Прорастание спор и отслеживаетсявыпуск DPA и фрагментов коры головного мозга 9. Для этого исследования было важно контролировать выделение фрагментов коры головного мозга, когда они начали быть освобождены прорастающих спор.
Колориметрический анализ , используемый здесь был основан на методе обнаружения сахаров с отрезными концами разработаны Ghuysen и др. 13. Так как другие описали протоколы для обнаружения восстанавливающих сахаров 14 или модифицировали эти протоколы 15, литература по этому вопросу может привести к путанице. Здесь мы подробно метод шаг за шагом для колориметрического обнаружения восстанавливающих сахаров , освобожденной от прорастающих C. несговорчивый спорами. Хотя это исследование использует C. несговорчивый споры, восстанавливающие сахара , выделяющиеся во время прорастания спор из других спорообразующих бактерий могут быть обнаружены с этим протоколом 9,16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
При стимуляции, спорами происходит процесс прорастания теряют свои свойства сопротивления без необходимости синтеза макромолекул. Когда спор прорастание срабатывает, ядро Спора выпускает DPA в обмен на воду 2. Из – за высокого содержания DPA неактивного споровых, ядро Спора под сил?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект описывается при поддержке премии Номер 5R01AI116895 из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института аллергии и инфекционных заболеваний или Национального института здоровья.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
Referencias
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
