三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

1.材料の準備林・ギブソンら 29によって記載された方法に従って、ポリエチレングリコールをmethacrylatingことにより、ポリエチレングリコールジメタクリレート（PEGDM、4,000 MW）を準備します。あるいは、PEGDMを購入することができます。 第ジメチルphenylphosphoniteは、ミカエリス – アルブゾフ反応を介して2,4,6-トリメチルchorideと反応させて、二段階のプロセスを介して、次いで、リチウム塩、光開始剤を合成し、リチウムフェニル-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate（LAP）真島ら30に従って、2-ブタノン中で臭化リチウムを添加することによって作成されました。 注：あるいは、他の光開始剤を購入することができるが、LAPは、より良い生体適合性と架橋効率31を示しています。 ガラスにヒドロゲルの接着を可能にし、それにより、撮像中の動きを防ぐために、カバーガラスを官能。 適切な個人用保護具と化学フードでは、使用TR-ゲル31のためのPC-ゲルおよびエポキシシラン（3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン）のために、製造業者のプロトコルに従って、3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート。注：または、プレコートスライドを購入することができます。カバースリップは、ステップ3.8でPDMS皿の井戸よりも大きくなければならないことに注意してください。 2.細胞トランスフェクション組織培養フード中で、滅菌技術を使用して、解凍サブ密集度で所望の細胞プレート（50 – 70％）を、6ウェルの非処理培養皿中で15,000細胞/ cm 2で、本明細書にウシ軟骨細胞。注意：任意の関連する細胞型を使用することができる、足場非依存性細胞を含みます。 細胞を37℃のインキュベーター中で一日のために回復することを可能にします。その後の工程の前に、培地を除去し、PBSですすぎ、そしてウェル当たり2ミリリットルフェノールおよび無血清培地を追加します。 各ウェルのための次の日、100フェノールおよび無血清培地μlのと同様に3を追加オートクレーブのガラス試験管にμlのトランスフェクション試薬。混合するために、軽くチューブを振ります。室温で5分間インキュベートします。光への曝露を制限します。 1μgの追加のDNAをプローブし、軽く振るFRET。室温で混合物をインキュベートし、光を避けて30分間。 注：この実験ではICUE1プラスミド（博士ジン張33の礼儀）を使用しました。 ICUE1中のフルオロフォアは、シアン蛍光タンパク質（CFP、ドナー）と黄色蛍光タンパク質（YFP、アクセプター）です。プラスミドDNAにトランスフェクション試薬の比は、異なる細胞型の最適なトランスフェクションのために調整が必要になります。 調製された混合物（〜104μl）を細胞に加えて、フェノールおよび無血清培地の2ミリリットルを含む6ウェルのそれぞれに滴下して配布します。アップピペットとダウンしないでください。穏やかに混合するためにプレートを渦巻きます。 48時間37℃でインキュベートします。注：コンフルエンシーは、トランスフェクション効率を阻害し、受容体の内因性の発現を変化させます。 3.製作ハイドロゲル鋳造および文化のためのPDMS金型上にポリジメチルシロキサン（PDMS）を鋳造するために大きなガラススライドを準備石鹸で第一のガラスを清掃し、多量の水で洗い流し、そして空気が続くイソプロパノールで、その後乾燥してください。 PDMSは容易に硬化後に剥離することができるように、製造業者のプロトコルに従ってシリ試薬とガラスを扱います。流域コンテナの上にトルエンで表面から残留試薬を洗い流します。空気の表面が完全に乾燥する前に、または待機時間を短縮するために100℃の熱を使用可能にします。 ヒドロゲルの高さ（ 例えば 、1ミリメートル）を選択し、PDMSの1.2倍の体積を計算ガラススライドおよびヒドロゲルの高さの寸法を使用して、この厚さのPDMSとガラススライドをカバーするのに必要な。注：PDMSは収縮しません。 ビーカー内の1の重量比：10でPDMSのキット成分を混ぜます。それは十分に混合された後、脱ガスにハウス真空下でビーカーを置きます。 REL気泡がコンテナをオーバーフローさせ、繰り返しを開始する場合は、真空をieve。 注：他のヒドロゲルの厚さは使用されるが、増加したバックグラウンドを犠牲にし、遠心分離（ステップ6.2）が使用されていない場合は、不透明度を増加させることができます。 PDMSを含むようにベースガラスの側面の周りにアルミ箔を包みます。慎重に箔に囲まれたこのガラス上に脱気したPDMSの所望の量を注ぎます。 PDMSの高さを測定します。 PDMSの高さは、ヒドロゲルの最大の高さになることに留意してください。注ぐときに気泡が作成された場合は、再度脱ガスやへらや針でそれらを開きます。 2時間100℃のオーブンでレベルの表面に未硬化PDMSを置き、または24時間、室温で残します。 それが硬化した後に慎重に表面からPDMSを削除します。ヒドロゲルのための所望の形状（3ミリメートルの例えば 、円筒形のパンチ）をパンチアウト。 注：光架橋が原因モールド径よりも若干狭くPC-ゲルシリンダーを得られますPDMS中の分子状酸素による反応の消光します。 パンチPDMSを滅菌します。短期間の実験のために、1時間、70％エタノールでPDMSを水没。 顕微鏡対物補正に合わせた厚さの滅菌ガラスカバースリップで滅菌PDMSのベースを嵌合することにより、金型を組み立てます。ステップ6での使用のために取っておかれます。 ヒドロゲルおよび培地を含むように（ヒドロゲルよりも広く、背が高いと）上記の方法を用いて、より大きなPDMS皿を製作。ハイドロゲルを浸漬すると、検体の希釈を最小限にするためにヒドロゲルより少なくとも10倍以上の媒体ボリュームを収容します。 ヒドロゲル前駆体溶液の4準備組織培養フード内で、滅菌技術を用いて、直ちに細胞を添加する前に、研究のためのヒドロゲル前駆体溶液を適切に準備します。次のようにポリマー前駆体からPC-ゲルを準備します。 リン酸緩衝生理食塩水（PBにPEGDM粉末を混合10％のS、pHは7.2）（w / vで）。 0.005の最終濃度で光開始剤（ 例えば、LAP）を追加- 0.01％（w / v）で、ピペッティングにより混合します。 LAPは、光に敏感であるように、光からアルミ箔またはシールドで溶液をカバーしています。 注：製造業者によって供給される。ここでTR-ゲル減少成長因子、細胞外マトリックスが使用されます。 ヒドロゲルソリューション5.細胞懸濁液組織培養フード内で、滅菌技術を用いて、ウェルから培地を吸引します。 ウェルにPBSを追加し、徹底的に取り付けられた細胞単層を洗浄するために削除します。 細胞解離溶液25 1cm 2当たり2〜3ミリリットルを用いて培養基質から細胞を解離します。 20分または解離するまで – 10、37℃でインキュベートした後、静かに揺らし。細胞を取り除くために、必要に応じて、しっかりと料理をタップします。 注：代替細胞解離ソリューションは、私はそうでないものに限られた選択肢を用意してい関心の受容体を切断することによって、分析中のシグナル伝達経路をMPACT。 細胞が分離された後、フェノールおよび無血清培地の2ミリリットルを追加し細胞を懸濁し、血球計数器で細胞を数えます。注：化学的に規定された無血清培地（ 例えば 、インスリン、トランスフェリンおよびセレンを補充した）を使用してもよいです。 滅菌バイアル、ペレット（ 例えば、2.0×10 6細胞1バイアルあたり）への細胞の種類に基づいて、所望の細胞数を等分。 上清を除去し、ヒドロゲル前駆体の所望のボリュームを追加し、ピペッティングにより細胞を懸濁。崩壊としてヒドロゲルのz軸を可視化する際にxy平面に2×10 5細胞/ cm 2が得られる前駆体の体積を使用します（ 例えば 、2×10 6細胞を含有する1ミリメートルの厚さのヒドロゲルのための1バイアルあたり1.0ミリリットル/ mlで）。気泡を発生させないように注意してください。 素早く<細胞生存率34に負の影響を制限するために、次のステップに進みます/ SUP>。 6.ハイドロゲルの調製組織培養フード内や無菌技術を使用して、ステップ3で調製した鋳型に細胞含有ヒドロゲル前駆体を追加する（ 例えば 、直径3mmのx高さ1mmの金型当たり7.1μl）を。 （固有のプローブ効率が不明である場合）、顕微鏡イメージング・システム較正およびプローブ較正のために使用することが、記載された同じ方法に従って、余分なヒドロゲルを作り出します。 遠心分離前の単一の焦点面に細胞を閉じ込め平面信号（ 図1）のうち、最小にすることによって画像化を最適化するためのゲル化/架橋に調製した細胞を含むヒドロゲル前駆体。前駆体の細胞型および粘度（4分間400グラム）に遠心時間と力を調整します。 ゲルまたは溶液を架橋 PC-ゲルヒドロゲルについては、に等しい露光時間のためのUV光源（λ= 365 nm）を持つ細胞含有前駆体を照射光架橋するミリメートル厚さ当たり3.2 J / cm 2です。 注意：計算で1ミリメートルの最小厚さを使用してください。エクスポージャーは1-5分の範囲に入る必要があります。最小露光時間を使用してください。過剰照射の生存率を減少させ、CFPドナーを漂白します。このような細胞を避けてください。高強度の照射がラジカル自己消光および乏しい細胞生存率につながるしかし、露光時間未満60秒が推奨されていません。 TR-ゲルハイドロゲルの場合は、シャーレ内に充填された金型を配置し、熱ゲル化へのインキュベーターに移動​​します。 37℃で30分間インキュベートします。 ゲル化またはヒドロゲルを架橋した後、PDMSヒドロゲル鋳型を除去し、（ステップ3.5から）を用意し、より大きなPDMS皿と交換してください。それを接着するための無菌のスパチュラでガラス上にダウンPDMSを押してください。 これは、シャーレなどの無菌容器内へのカバースリップで皿をPDMS置きます。フェノールフリー無血清培地を追加するか、または化学的に私に定義されましたよく浸しヒドロゲルを保つために、PDMS皿とカバーガラスを使用して作成するdium（インスリン、トランスフェリンおよびセレンを補充した無血清培地（ステップ5.4））。 37℃で30分間インキュベートします。 注意：カバーガラスで特殊な皿を使用している場合は、その中にカバースリップを配置し、同様にメディアを追加します。 代わりに、照射波長がCFPドナー励起スペクトルと重なるように、プローブが回復することを可能にするためにFRETイメージング前日、この手順を実行します。 7. 3D FRETイメージングステップ6.4で調製したペトリ皿からヒドロゲルとPDMS皿を外し、XYの顕微鏡ステージ（ 図2）のための調整可能な試料ホルダーに固定します。顕微鏡ステージ上の試料ホルダーを置きます。必要に応じて、客観的にオイルを適用します。比較的弱い蛍光体を捕捉するために、少なくとも40Xと高開口数（NA）の（ すなわち 、1.3 NA）の対物レンズを使用します電子放出。 画像取得のためのビュー（のFOV）のフィールドを設定します。透過光イメージングを用いたイメージング用の細胞を選択し、蛍光イメージングでのトランスフェクションを確認します。少なくとも15の異なるセルを選択してください。 どちらも明るすぎず暗すぎ（そうでなければ過飽和または低感度プローブするためにつながる可能性がある）と、（そうでなければ、バイナリプローブの損傷や崩壊を示す）0.0と1.0の間のFRET比であるセルを選択します。その後、露出を制限するために、光をオフにします。 （ 図3Bおよびステップ以下の9.2を参照）ヒドロゲルの中心に、比較的フラットな照明フィールド内の目的の細胞と密接のFOVを選択します。 FRETの画像チャネル用のカメラ設定を構成します。 「光学的構成」（ すなわち 、露出、画像チャネルあたりの利得）を最適化するために、FOVの中心付近の少数の細胞の間で選択してください。 注：下記の命名法はdependin異なります顕微鏡とカメラを操作するために使用されるソフトウェアにグラム。顕微鏡ソフトウェア、NIS-要素は、画像キャプチャおよび分析のためにここで使用されます。 アクセプター励起（AEM）の下で、ドナーの励起とアクセプター発光の下でドナー発光で急冷放出（QE）、：一本鎖プローブのFRET分析のために、FOVごとに2つの画像チャネルを選択します。 注：ICUE1 CFP-YFPプローブ、QEのためのCFPの励起および発光フィルターペアについては（418​​から442元、458から482 EM）とAEMのためのYFPの励起および発光ペア（490から510元、520から550 EM）使用されています。 バックグラウンドノイズを最小限に抑えるために（最小限の可能利得で、CCDを使用している場合）、飽和せずに最大の信号強度を取得するためにQEとAEMのための露出を設定します。 図 （結果（ すなわち、励起パワー、アイリスの大きさ、露出、カメラゲイン）を付勢回避するために、両方のフルオロフォアのために同じ光の設定を維持し、実験を通して、ならびに実験群の間でUREの3A）。 買収後のより多くの分析オプション（ 例えば、補正後の増感発光（CSE）イメージング（説明を参照））を可能にするために追加の画像チャネルを取得します。エムドナー （QE、顕微鏡ソフトウェアで選択CFP-CFP）、例のドナー – -エムアクセプター （SE、選択CFP- ICUE1 CFP-YFPプローブの場合は、励起（例）と例のドナーの放射（エム）チャネルを取得YFP）、例アクセプタ -エムアクセプター （AEM、YFP-YFPを選択）、および実施例アクセプタ -エムドナー （YFP-CFP）の構成（ 図3Aを参照してください）。 タイムラプス画像取得のための捕捉率を設定します。 ハードウェアによって制限される場合捕捉率を低下させます。短期アッセイのために（ 例えば、30 – 60分）、シグナル動態を捕捉するために、各FOV（5秒のサンプリングレート）毎分約12の取得を示します。 signiを回避するために必要な最小のサンプリングレートを使用しますficantlyプローブを光退色。 顕微鏡ソフトウェアでキャプチャの周期を入力して取得レートを設定します。長期的なアッセイ（ 例えば 、24時間）のために、すべての5〜10分、例えば 、初期パルス応答をキャプチャし、低取得速度に切り替えるには、高い取得速度で始まります。 選択画像の取得を開始し、指定のFOVにおけるプローブ応答のベースラインを確立するために、5分間の画像をキャプチャするために、顕微鏡ソフトウェアの「現在実行」。 希望のアゴニストまたはアンタゴニスト検体中の画像取得、ピペットの5分（ 例えば、100 nmでのフォルスコリン）した後、ピペッティングにより混和し、撮影を続けます。 8. FRETキャリブレーションシステムのキャリブレーション：同じFOV条件、光学的構成、およびカメラセットを使用して少なくとも6代表的な細胞のAEMの画像を取得するために、ステップ6で説明したように作製し、さらなる較正ヒドロゲルを使用リントは（ステップ7.1、7.2、および7.3）上記のFRETイメージングのために使用されます。 注：組み合わせられたプローブと顕微鏡イメージングシステムのための量子収率および分光感度（QS）の定量は、「絶対」FRET分析ではなく、「相対」FRETのために必要とされます。 フル強度（AEMチャネル上で励起）で励起光に5分長時間露光を選択することにより、アクセプターフルオロフォアを光退色。興味のある細胞のみを漂白する狭い開口部を使用してください。 AEM信号は前と光退色後の信号強度ヒストグラム（「LUT」ウィンドウ）を比較することにより、元の信号よりも少なくとも10％低いことを確認します。信号損失が90％未満である場合、光退色続けます。 注：ドナーフルオロフォアがドナーの励起スペクトルと重複しないAEM励起フィルターを使用して、この手順の間に漂白されていないことを確認。 今漂白アクセプターフルオロフォアとドナー励起下で私たちを（DEM）をドナー発光を買収ステップ7.3でのQEと同じ光学構成をる。 以下のセクション9のように、バックグラウンド補正後AEMで割っデムような画素あたりのQSを計算します。 QS =デム/ AEM 携帯平均値からのセル間の平均QSを計算します。 キャリブレーションサンプルを用いたプローブ（EI）の固有のFRET効率を推定します。プローブの最大FRETを誘発し、Eiは= 1を計算 – QE /下のセクション9のように（AEMは、QSをX）。 （QE / DEM） – 代わりに、Eiは= CSE / AEM、またはEiはEiの= 1とFRET効率のための従来のエンドポイントアッセイを用いて計算します。 注：Eiは活性化プローブ（FAP、 すなわち 、検体を結合プローブの割合）の絶対割合を定量化するために必要ですが、FRET「相対的」分析のために必要されていません。 検体と相互作用するとFRETの増加プローブの分析物の生産/活性化のアゴニストと文化を刺激することによって、プローブ応答を飽和。 プローブを阻害interactio分析物に結合するとFRETの減少のプローブのためのシグナリングの拮抗薬を使用して、検体を有するn。注：ICUE1プローブの場合には、「このような2などアデニルシクラーゼ阻害剤でcAMPレベルを抑制し、5'-ジデオキシアデノシン（特異的）または3-イソブチル – メチルキサンチン（非特異的）。 9. FRET比算出時間をかけて各FOVでバックグラウンドレベル（ 図3B）を定義しますが、画像（ 図4Aの中心にわたって比較的均質な照明の領域にROIを制限するために、細胞の近くにFOVごとに関心のある領域（ROI）を描画し、指定）。バックグラウンド補正オプションの説明のための議論を参照してください。 顕微鏡のソフトウェアを使用すると：「背景ROIアイコン」の矢印を選択し、（他の形状も動作します）「楕円背景ROIを描画」を選択します。 「オフセット背景を更新し続ける」ことを確認してください選択されています。争うアクティブ化背景ROIのアイコンをクリックして、背景ROIの翼。代わりに、「ROIのアイコン」と「背景ROIとして使用する」に設定したROIのプロパティを使用し、「ROIが各マルチポイントで異なっています」。 ImageJのでは：円形の描画ツールを選択するには、ツールバーを使用してください。次に、 "→ツール→ROIマネージャーの分析」メニューからROIマネージャーに図形を追加します。必要であれば、ROI Managerで背景ROIのための別の色を設定します。 各FOVと画像チャネル（ 例えば、QEとAEM）の場合は、チャンネルごとに補正画像を作成するために、時点ごとに背景ROI内の平均値を減算、 例えば、SQE のT、P = QEのT、P – BQE T、P tは取得時間であり、pは FOV（ すなわち、XY位置）であり、BQEとbAemは、背景ROI内の信号のスカラー値です。ソフトウェアで利用可能な画像の算術関数を使用します。 W顕微鏡ソフトウェアi番目、「ROIの背景アイコン」を使用し、「減算背景ROIを使用」を選択します。ポップアップウィンドウで、「上減算背景ROI」の「すべてのイメージ」を選択し、「適用先」の下の「すべてのフレーム」を選択します。 注：背景ROIが正しく動作するために、この機能のために、すべてのFOVで定義する必要があります（ 例えば 、いくつかのFOVは未定義のバックグラウンドのROIを持っている場合、機能が正常にバックグラウンドのROIとFOVのためのバックグラウンドを減算しません。）。 ImageJのでは、マイケル・カメロ（http://microscopynotes.com/imagej/macros/）によって書かれた「BG減算ROIから「マクロを使用しています。 以下の分析手順については、「名前を付けて保存」を選択することで、画像の補正された時系列を保存します。 各FOV（ 図4B）で分析中の各セルのバイナリマスクを用いて細胞の周りにROIを定義します。スタートOにおけるしきい値にFOVあたりの画像をAEMチャネルを使用実験F、セル境界を識別し、関心領域を定義しました。 ROIを保存します。 顕微鏡ソフトウェアで：各フレーム（ すなわち 、FOV）、最初の「バイナリ→は、しきい値の定義」メニューを使用し、「現在のフレームに適用」を選択します。セルを選択するために、下限しきい値を調整します。その後、必要に応じてバイナリマスクの穴を埋めるために「バイナリ→閉じる」関数を使用します。次に「ROIにコピーバイナリ」を選択するために、ROIのアイコンを使用します。バイナリ層は自動的に削除されます。 ROIの既存のプールに後続フレームのためのROIを追加します。任意のスプリアスのROIを削除します。次のROIの「右クリック」とそのプロパティが「標準ROIとして使用する」され、「関心領域は、各マルチポイントで異なっている」ことを確認してください。 ImageJのでは：各FOVについて、最初の "→しきい値を調整して画像→「メニューを使用します。そして、ショーアウトラインで「粒子の分析→分析」を使用し、選択したマネージャに追加します。つかいます「バイナリ→閉じる」を必要に応じてバイナリマスクで「穴」を埋めるために。スプリアスのROIを削除します。無料のプラグインは、このプロセスを自動化するために利用可能です。 各ピクセルのQEベースのFRET比を計算し、SQE / SAEMは、相対的な分析のために（ステップ10を参照）およびE QE = SQE /ステップ8.1で得られたQSとの絶対的な分析（ステップ10を参照）（QSは、SAEMをX）。画像の浮動小数点除算を使用してください。比の導出を説明するための議論のセクションを参照してください。 顕微鏡のソフトウェアを使用すると：メニュー「イメージ→画像の操作」を使用し、「浮動小数点」を選択します。 ImageJのでは：「プロセス→画像電卓」機能や「Calculator_Plus.java」プラグインのいずれかを使用してください。注：代わりに、マクロ」に適合させることができるの.txt "pH_ratioMacroは「FRET比を計算するためには、上記のバックグラウンド補正のマクロを使用し、で入手可能です。 表計算やグラフ作成ソフトに（ROIごとに、すなわち ）細胞当たりの平均比率をエクスポートします。 顕微鏡のソフトウェアを使用すると：「ROI統計」解析制御または「時間分析」分析制御における「スプレッドシートのエクスポート」ボタンでNDのエクスポート]ボタンのいずれかを使用します。 ImageJのでは：まず "→設定測定値を分析する」メニューを選択し、「平均値」と「標準偏差」が選択されていることを確認します。そして、ROI Managerを使用し、ボタン「測定」を選択します。生成された結果ウィンドウを保存します。 10. FRET比分析セル当たりの平均比からの時間にわたる平均セルラーFRET比を計算する（ステップ9.4でエクスポート）。この計算では、ベースラインFRET比（分析物を投与する前比）を検討してください。 注：スプレッドシートとグラフ作成ソフトウェアは、ベースラインsubtrをプロットするために使用されていますステップ10.1.2と（ 図5および6）下記の10.1.3のように、ベースライン上の線形回帰を使用して、平均FRET比および平均のそれらの標準誤差（SEM）を務めました。 相対的解析（応答の大きさ）：共通の基準サンプル（ 例えば 、未処理試料）に各曲線を正規化。 絶対的な分析（応答の時間経過）：そのベースラインFRET比で各曲線を正規化することによって、共通の開始点に曲線をシフトします。 表計算やグラフソフトウェアでは、新しい列を持つデータ（セル当たりの平均比の列）をインターリーブ、それぞれ元の列がベースライン期間（分析対象物を追加する前比）のためにのみ比データを含む新しい列とペアになっているように。データのすべての列の後に空の列を挿入するには、「列の挿入」を選択します。その後、対になった空の列にベースラインデータをコピーします。 表計算やグラフソフトウェアでは、「挿入→新しい分析→Transfoを選択RMベースラインを削除」した後、設定された「他のすべての "に"選択した列を「選択」ベースラインが直線的であると仮定」、および選択 ""計算 "の下に"違いを。 平均の細胞比と記述統計を計算します。表計算やグラフソフトウェアでは、「SDまたはSEMで行手段→挿入→新しい分析]→[XY分析」を選択し、ポップアップウィンドウで「行をSEMと意味」を選択します。