高通量设置的建立筛选小分子能调节C-二GMP信令<em>绿脓杆菌</em

注：纯化的c-二GMP报告质粒的克隆和转化过程在别处讨论12。 1.绿色荧光蛋白的生成标记的c-二GMP记者P.假单胞菌 接种5毫升LB培养基的（LB）培养基与P的单个菌落假单胞菌和以200rpm振荡孵育过夜，在37℃。 传送2毫升过夜培养物加到200ml新鲜LB培养基在1L烧瓶中，并在37℃以200rpm摇动孵育。 在600nm（OD 600）通过从烧瓶中取1毫升样品，并检查使用分光光度计（如前面描述12），每30分钟监测光密度。 当OD 600 0.3之间达到- 0.5，放置40毫升培养到50毫升锥形离心管中。 通过在4℃以8,000rpm进行10分钟离心沉淀细胞，弃去上清液并且r电子暂停于40ml冰冷，无菌300mM的蔗糖溶液中的细胞。 通过如步骤1.5中所述和在20毫升的冰冷无菌，300毫蔗糖溶液再悬浮离心沉淀细胞第二次。 通过如步骤1.5中所述，并在400微升冰冷的无菌，300毫蔗糖溶液再悬浮离心沉淀细胞的最终时间。 注意：此时的细胞密度应为每毫升约1×10 11菌落形成单位（CFU / ml）中。 冷却在冰上将细胞30分钟，之后，他们准备好电穿孔。 添加0.2微克/微升pCdrA :: GFPÇ质粒12溶液，1微升至40微升的P.在1.5 ml离心管，其已经在冰上预冷的上面制备假单胞菌电感受态细胞。混合该悬浮液，并转移到预冷的，及2mm电极间隙，电穿孔杯中。 注：pCdrA :: GFP </em> C：pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP（Mut3）-T 0 -T 1，放大R通用汽车研究 ，这给了C-二GMP的体育细胞内水平的荧光读出假单胞菌菌株，开发并通过Rybtke 等人 12的验证。 上用薄纸的反应杯的外侧除去水分，然后将反应杯放入电穿孔的样品室中。脉冲与2.5千伏，25μF的电容和200Ω电阻的电压。 取出试管，加入1 ml LB培养基。然后，将细胞转移到无菌的1.5 ml离心管，并在37℃下以200rpm摇动孵育2小时。 蔓延10微升，50微升和培养的100微升等分试样到补充有氨苄青霉素（在100微克/ ml的浓度）无菌的LB琼脂平板上，并在37°C孵育平板过夜。 确认GFP表达（excitati关于在485纳米，在520纳米发射）通过与标准的GFP通道在荧光显微镜下检查板，并挑选单菌落来接种5毫升LB.如步骤1.1中所述孵育过夜。混合将0.5ml过夜培养物用在2 ml0.5毫升50％甘油螺杆上管并储存于-80℃。 2.制备发酵剂培养物接种屏幕前两天，镀P.假单胞菌菌株（含有pCdrA :: GFPÇ质粒）从-80℃的库存到的LB琼脂平板通过用无菌接种在板轻轻扩频细菌（补充有氨苄青霉素100微克/ ml的浓度）循环。过夜孵育所述板在37℃。 放映前的晚上，接种P的单个菌落从板到10ml LB培养基的绿脓杆菌在涂（以100微克/毫升的浓度补充有氨苄青霉素）是并以200rpm摇动孵育在37℃下预培养过夜。 在屏幕的当天，通过用新鲜LB培养基首先稀释到的OD 1.0 600，然后进一步用5％的LB稀释至OD制备从过夜预培养一个传代培养0.04（1:25比率）600 。 注意：接种培养基的总体积取决于板的数目进行测试。 5％的LB通过稀释100％的LB用磷酸缓冲盐水（PBS），以所需的浓度进行。重要的是，媒体（5％LB）允许pCdrA构激活::在P. GFPÇ 铜绿假单胞菌 。 以最低的速度在磁力搅拌器上添加无菌磁力搅拌棒放入容器中，并搅拌所述培养在室温下30分钟，使它们被分配到384孔板之前细菌使其恢复到该介质。 包含384孔板3.接种和孵化小分子注意：不育和良好的无菌技术是最重要下面的步骤。 要准备阳性对照（100％抑制），加入20微升硫酸妥布霉素（25毫克/毫升）在步骤2.3准备的亚文化10毫升（充足长达12板），轻轻混匀。吸移管将40μl阳性对照培养的成孔A23 – P23（ 图2）。 以制备阴性对照（0％抑制），添加30微升二甲亚砜（DMSO）中，以在步骤2.3中制备的传代培养中的10ml（足够多达12片），并轻轻混合。吸移管将40μl阴性对照培养的成孔A24 – P24（ 图2）。 对于每一个与小分子加盖板的，接种40微升稀释过夜培养物（在步骤2.3中所述）的入井A1的体积- P22（ 图2）。 注意：这可以使用液体处理器抢来实现OT。由于细菌培养物的异质性，重要的是保持连续和适度搅拌以保持细菌始终如一地分布在媒体而分配是重要的。要做到这一点，请从步骤2.4搅拌水土不服文化磁力分配过程中。 密封与透气性盖密封所述板，并在37°C孵育6小时。 注意：可透气密封是至关重要的，以保持在所有384个孔不变的条件和横跨板绕过氧气梯度的潜在发展。 4.生长（OD 600）和细胞内的c-二GMP水平测量（GFP） 前约30分钟光度法测量，预暖板读取器至37℃，以避免冷凝。 阅读前轻轻地取出透气盖公章。测量在600nm波长下的光密度为每孔10闪烁的设定和0.2秒的稳定时间。 之前测量荧光，使一个自动增益和焦点调整基于以及A24（阴性对照），并在75％（ 图2）设置的增益目标值。 从酶标仪控制软件，点击开始测量，然后点击“”焦点和增益调节/板标识'标签。 选择窗口右侧'调焦''和''通道的''。 选择'增益调整''和''选择好''和''75''为''目标值'类型英寸最后，点击'开始调整'前板布局挑好A24。一旦调整完成后，点击'开始测量'。 测量从GFP报告荧光在五百二十零分之四百八十五纳米的激发/发射最大值与每孔和一个settli 10闪烁的设置NG时间0.2秒。 收集审查所有板块的数据。注：数据读数被自动保存在酶标仪控制软件默认。 通过点击“火星人”图标，在控制软件中打开的统计分析软件包查看读数。 检索由在感兴趣的盘数“双击”数据访问数据进行分析。 5.数据分析评估使用鲁棒Z'分析，这是报告的高通量筛选中最常见的质量度量测定的均匀性和再现性。强大的计算Z'用以下公式： 哪里的MAD（平均绝对偏差）是标准偏差的估计值，p是阳性对照（100％抑制），n是阴性对照（0％抑制）为外径600和GFP values​​。注意：用健壮Z'值大于或等于0.5（同时适用于外径600和GFP的原始数据计算出的）的测定被认为是一个极好的测定。 计算使用下式生长的抑制％： 其中xi OD600是每个样本的迭代OD值600好。 ％抑制OD600> 0，生长抑制剂;抑制％OD600 <0，促生长剂。 评估使用式C二GMP的细胞内水平的％抑制（任意荧光强度单位的改变而在细胞密度的变化校正）： 其中xi GFP是每个样本的迭代GFP值好。抑制％GFP> 0，C二GMP抑制剂; ％＃160;抑制GFP <0，C二GMP启动。 在从中间（中位数±3 MAD），从样品计算3 MAD设置命中检测的阈值以及读数各板的，假定的数据点正态分布。注：但是，±50％抑制截止可以更多的再现和精确的剂量反应测定如果需要选择。