There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.
창자 – 신체의 모든 장기의 면역 세포의 최대 개수를 포함 – 끊임없이 외래 항원, 미생물 및식이 모두 노출된다. 소장은 전신 질환의 숫자에 중요한 내에서 이러한 내강 항원이 면역 반응과 면역 세포의 교육을 형성하는 데 도움 것을 증가 이해 감안할 때, 장내 면역 체계의 특성에 대한 관심이 증가하고있다. 그러나, 많은 문서 프로토콜 힘들고 시간 소모적이다. 우리는 빠른 재현하고 힘든 퍼콜 구배를 필요로하지 않는 소형 장내 점막 고유 층, 상피내 층 및 파이어 패치에서 림프구 분리 여기 간단한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜 소장에 초점을 맞추고 있지만, 또한 결장의 분석에 적합하다. 또한, 우리는 특정 과학 QUES에 따라 추가 최적화를해야 할 몇 가지 측면을 강조기. 이 방법은이어서 유세포 분석 또는 특성화의 대체 수단을 사용할 수 림프구 가능한 다수의 분리가 발생.
소장의 주요 작업은 종종 영양 (1)의 분해 흡수가되는 것으로 간주된다. 대사 기능이 명확 필수적이지만, 소장의 루멘 내에있는 환경이 항원의 연속 사격으로부터 숙주를 보호 동등하게 중요한 역할을한다. 장내 외부 세계를 분리 (예., 내강 항원) 단일 전지 층 두께 상피 층 호스트의 내부 환경에서. 이와 같이, 작은 창자의 면역 시스템은 침입 병원균에 대한 강력한 대응을 설치하는 동안 최소한의와 점막을 입력식이 요법과 공생 미생물에서 외국 항원을 수있는 경우, 면역 반응을 반응성에 대한 임계 값을 균형의 강력한 작업이 다른 "유해한"항원. 이러한 항원에 대한 과도하거나 부적절한 면역 반응은 (병리학 적 질환으로 이어질 수 있습니다 예를 들어,., inflamma토리 장 질환, I 형 당뇨병, 다발성 경화증)과 3-6을 피해야한다.
전반적으로, 위장관 모든 항체 – 분비 세포 (7)의 70 % 이상 함유, 신체에서 가장 큰 면역 기관을 나타낼 것으로 생각된다. 고유 판 (LP)에서, 상피내 층 및 파이어 패치 (PPS) – – 작은 장 면역 체계는 3 개 주요 구획으로 구성되어 각각이 림프구의 독특한 그룹을 포함하는 것이다. LP에서 림프구 (LPLS)은 ~ 20 %의 B 세포 주로 TCRαβ + T 세포이고; 상피내 림프구 (IELs)는 TCRαβ + T 세포보다 TCRγδ + T 세포와 B 극소수의 셀을 포함하고; 그리고 작은 창자 벽에 내장 된 차 림프 기관이다 보호 프로파일은 ~ 80 %의 B 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 해부학 적 영역의 각이 약간 별개의 기능과 존재 론적 기반을 가지고 있지만, 그들은에서 작동 아armonized 패션 병원성 모욕에서 호스트를 보호 할 수 있습니다.
또한, 미생물은 특정 미생물, 특히 세포 계통 8,9의 개체 발생의 동족 관계의 인식이 증가함에 따라 장 면역계의 개발을위한 중요한 결정이라고 성장 하락이있다. 또한, 장 면역계의 교육 해부학 먼 부위에 대한 면역 반응에 영향을 미치는 것으로 특정 (예., 관절염, 다발성 경화증, 폐렴), 그 이전에 10 인식보다는 장 면역계의 개발은 더욱 질병 과정에 중요한 것으로 명백 해졌다 -12. 이와 같이 정량적으로 장내 면역 체계를 평가에 대한 관심이 지금 호스트 공생 상호 작용과 많은 전신 질환의 발병도를 포함하는 호스트 병원체 상호 작용 이상으로 확장했다.
현재 방법의 가변성을 감안장내 림프구 분리, 필요한 시간 밸런싱 점점 중요하면서 수율 가능성 및 일관성을 최적화하는 방법. 퍼콜 구배를 포함 프로토콜, 시간과 노동 집약적과 인간의 오류 가능성이 더 많은 경향이 변수 수율로 이어지는 13을 생존. 여기서, 우리는 3 작은 창자의 면역 구획에서 림프구의 분리 및 특성에 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 또한, 점막 면역 체계에서 미생물에 의한 변화에 주어진 관심이 높아지고, 우리는 이러한 변화가 정량적으로 장내 면역 체계에 미치는 영향을 평가하기 위해 마우스와 미생물의 수평 전송을 허용하는 데 사용할 수있는 단계를 포함한다.
우리는 분리를위한 프로토콜을 제시하고 보호 프로파일의 LPLS, IELs 및 림프구를 포함한 작은 장 림프구의 세포 계측 특성 흐름. 미생물의 변화가 작은 창자의 면역 체계에 미치는 영향을 평가에 관심있는 경우, 우리는 세부 사항 다른 microbiotas을 품고 마우스와 생물의 수평 전송에 관련된 간단한 단계. 이 프로토콜은 소장에 초점을 맞추고 있지만, 순서는 오직 차이가없는 프로파일 제거되지한다 (…
The authors have nothing to disclose.
NKS is supported by NIH award K08 AI108690.
Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
metal feeder | Innovive | M-FEED | |
water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
fetal bovine serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
10 ml syringe | BD | 305482 | |
PBS | Gibco | 14190-250 | |
Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
stir bar | VWR | 58949-062 | |
multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
1.5 ml tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
100 μm cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
50 mL conical tube | Falcon | 352098 | |
1 ml syringe | BD | 309659 | |
96-well plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
(optional) fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
10% formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |