전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교
Summary
This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Abstract
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
Introduction
생존에 필요한 영양분을 얻기 위해, 악성 종양 환자의 혈류에 대한 액세스를 필요로한다. 이 액세스하기 위해, 종양 세포는 혈관 신생 따라서이 알려져 정상 생리적 과정을 하이재킹, 종양으로의 새로운 혈관의 성장을 자극하는 화학적 신호를 방출. 그것은 전이 (즉, 다른 장기 암의 확산)이 발생할 수있는 혈관을 통해 생성 된 혈관을 통해도. 혈관 신생 과정은 암과 같은 다양한 종류의 진행에 매우 중요하기 때문에, 항암 치료 연구 (3)에서 매력적인 표적이다.
혈관 생성을 정량화하기 위해 사용되는 하나의 방법은 세포 외 매트릭스 상에 배치 할 때 튜브를 형성하는 혈관 내피 전구 세포의 능력을 측정하는 것이다. 이러한 관의 형성은 환경 조건 (소정 주식의 예 존재 또는 부재를 테스트 혈관 신생에 중요한 초기 단계이기 때문에,mpound) 자극 또는 억제 할 수있는 관 형성은 혈관 신생을 억제하는 대상이 될 수있는 특정 단계에 대한 통찰력을 제공합니다. 내피 세포의 관 형성 분석법은 튜브를 형성하는 세포의 능력을 측정하는 가장 널리 사용되는 4 시험 관내 방법 중 하나이다. 그것은 상대적으로 적은 부품 및 짧은 배양 기간 5를 필요로 간단한 분석이다. 아마도 가장 중요한 것은, 분석이 유형에서 얻은 데이터를 정량화 점이다.
관 형성 어 세이를 사용하는 예를 저감 성장 인자 (GFR) 외 기질 대 외 매트릭스상에서 성장한 혈관 내피 세포의 튜브의 개발을 비교 포함한다. 라미닌, IV 형 콜라겐, 성장 인자 및 프로테오글리칸은 세포 외 기질이 육종 세포의 주요 구성 요소에서 고립 된 기저막과 같은 소재입니다. 일부 화합물의 튜브를 형성하는 세포의 능력에 상이한 효과를 가질감소 된 성장 인자 감소 헤파 란 황산 프로테오글리칸 (HSPGs)와 환경. HSPGs 크게 GFR 외 기질이 감소되는 세포 외 매트릭스의 구성 요소이다. 예로서, 상기 가정은 HSPGs이 풍부한 관 형성을 방해하기 위해 상당히 강한 능력을 차단 CXCR2 수용체, SB225002와 같은 혈관 신생 억제제는 다음 세포 외 기질 및 GFR 외 매트릭스의 관 형성 활성의 비교임을인지 HSPGs의 제어를 통해 혈관 신생 억제 가능성 탐구 중요.
일반적으로 혈관에서의 화합물의 효과를 결정하기 위해 사용되는 다른 분석은 생체 내 방법에있다. 이 중 주목할만한 예는 닭 계란을 사용하여 병아리 융모 막 (CAM) 분석 (6), 그리고 생체 내 마트 리겔은 마우스를 사용하여 혈관 신생 분석 (7)를 연결합니다. 생체 내 방법은 t에서 혈관 신생을 측정하는 동안HREE 치수 및 관내 관 형성 분석법에 비하여 인체에 더욱 대표적인, 그들은 훨씬 더 많은 시간을 필요로한다는 결점을 겪고 상당히 더 수행하기 어렵다. 캠 분석 및 세포 플러그 분석 모두 비하여 관 형성 분석법은 하루에 수행 될 수 있지만, 이렇게하는 적어도 하나의 주 8 가지고 그것은 동물 사용을 요구하지 않는다.
이 보고서에서 사용한 혈관 내피 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이들 세포는 혈관 새싹 및 혈관의 성장에 중요한 역할을하고, 충분한 양의 시험 관내 및 생체 내 실험 9 항 – 혈관 형성 활성을 평가하는데 사용될 암에서 내피 세포 유사하다. 일차 미세 혈관 내피 세포와 같은 다른 세포도 사용될 수있다.
낮은 갖는 외에주의하는 것도 중요하다정상 세포 외 기질에 비해 HSPGs 수준은 또한 GFR 외 매트릭스는 여러 요소 레벨을 감소시켰다. 이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다 : EGF, IGF-1, PDGF와 TGF 베타. 혈관 신생 관련 화합물의 중요성을 공부하고 그 수행하는 실험은 GFR 세포 외 기질을 사용하여에 관심이있을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 분석을 수행 할 때, 달리 명시되지 않는 한 항상 얼음 상 또는 4 ℃에서 세포 외 기질을 유지하는 것이 필수적이다. 세포 외 기질을 4 ° C 이상으로 가온하는 경우는 중합되고, 상기 분석은 파괴 될 것이다. 그것은 접촉하는 것을 확인하는 것이 중요하다 (예를 들면, 피펫 팁, 플레이트) 세포 외 기질과 미리 냉각 전술 한 이유입니다. 각 웰에 파종 세포 수는 중요하다 너무 적은 세포의 대조군 샘플에서 예상되는 웹주지 너무 많은 세포 대 세포 클러스터 또는 단일 층을 형성하는 것이며, 상기 분석은 유효하지 않을 것이다. 이 분석의 성공에 또 다른 중요한 요인이 된 HUVEC 세포의 통로 번호이다. 통로의 수는 항상 그렇지 않으면 강력한 관 형성이 발생하지 않을 수 10 이하이어야한다. 또한, 하나는 사용되는 세포 배양 배지가 만료되지 않았는지 확인한다, 또는 세포 생존 수 없습니다. Alternatively, 하나 매체와 그 구성 요소와 나누어지는 유효 기간 후의 일정 기간 동안 유지하기 위해 -20 ℃에서 저장할 수있다. 물론, 유효 기한 전에 매체를 사용하는 것이 여전히 바람직
모든 절차와 마찬가지로, 내피 세포의 관 형성 어 세이를 수행하는 몇 가지 단점이있다. 하나의 주요 문제는 내피 세포와지지 매트릭스의 종류가 있기 때문에, 분석의 결과는 셀 매트릭스 타입 사용에 따라 크게 달라질 수 있다는 것이다. 사용 된 내피 세포 (HUVECs를, HAECs 또는 HMVECs)는 그들이 불멸화 세포에 비해 변동성을 얻을 가지고 비용이 많이 드는, 일차 전지이다. 기본 셀은 사용 제한 통로를 가지고, 따라서 장기 실험 혈관 (14)에 적합하지 않다. 신뢰성있는 데이터의 경우, 하나는 항상 상기 분석에 대해 동일한 유형을 사용한다. 시험 관내 분석에서 서로 같이, 관 형성 어 세이의 결과들은 콘되어야이차원 조직 배양의 제어 및 합성 조건의 결과는 항상 생체의 복잡한 바이오 시스템에 반영되지 않을 수 있기 때문에, 생체 내에서 강세. 또한, 튜브 형성 세포 분석법이 유형 단지 내피 세포의 관 형성을 입증하는 데 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하고, 다른 비 – 내피 세포를 검사하는 데 사용되어서는 안된다.
이 분석은 화합물의 혈관 가능성을 정량화 할 수있는 비교적 간단하고 빠른 방법입니다. 또한, 단독으로,이 화합물은 실제 혈관 형성 공정에 영향을하는 특정 메커니즘에 관한 정보를 생성하지 못하고, 추가 실험을위한 플랫폼을 형성한다. 그러나, 다양한 세포 외 매트릭스의 사용이 더 일반적으로 사용되지 않는 연구 질문을위한 프레임 워크를 만드는 방법의 예입니다. 구성 요소를 대상으로 특정 억제제를 포함하는 화합물의 특정 생화학 적 메커니즘을 연구하는 방법이있다혈관 신생 경로. 또 다른 방법은 내피 세포로부터 RNA를 추출하고 분석에서 관찰 된 성장 거동을 일으킬 수의 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 RT-PCR (실시간 PCR) (12)를 사용할 수있다. 이 방법의 미래 응용 프로그램은 혈관 신생 경로의 특정 단계에 대한 노크 다운 분석을 생성 된 HUVEC를 형질 전환 등이 있습니다. 림프관 경로를 연구하기 위해이 방법을 적용 할 가능성이있다. 세포 외 기질 성분을 변경하여, 행렬 암에서 혈관 신생을지지 세포 과정의 상호 작용이 더 설명 될 수있다. 이러한 특정 조건하에 내피 세포로부터 RNA와 단백질의 추출은 추가적인 정량적 데이터는 데이터를 묘화에 대응 제공한다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
Materials
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
Referencias
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