Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
Drosophila genetiği gücü giderek hormon sinyalizasyon ve metabolizma soruların ve bu organizmanın insan hastalık modellerinin geliştirilmesi için uygulanmaktadır. Böyle metabolik oranları gibi parametrelerin ölçümleri için hassas metotlar, meyve sineği gibi küçük hayvanlarda fizyoloji ve hastalığın daha iyi anlaşılmasını götürmek için gereklidir. Burada anlatılan yöntem, glikoz veya yağ asidi olarak 14 C-etiketli yüzeylerde eser miktarda içeren yiyecekleri beslenen yetişkin sineklerin az sayıda yakıt oksidasyonu değerlendirir. Besleme süresi ve herhangi bir ek deneysel manipülasyon sonra, sineklerin, radyo-etiketli CO2 potasyum bikarbonat gibi radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda elde sonra trans nefes verme KOH doymuş filtre kağıdı içeren cam şişelere yerleştirilir mesh başlıklı kısa tüpler aktarılır KHCO 3. Bu radyo-etiketli bikarbonat, sintilasyon sayımı ile ölçülür. Bu aq olduğunuYakıt oksidasyon çalışmaları için, uantitative tekrarlanabilir ve basit bir yaklaşım. Radyo-etiketli glükoz, yağlı asitlerin ya da amino asitlerin kullanılması, besleme ve aç kalma gibi, farklı genetik geçmişlerde, farklı koşullar altında bir enerji metabolizması için bu farklı yakıt kaynaklarının katkı belirlenmesini sağlar. Bu in vivo enerji metabolizmasında ölçmek için kullanılan diğer yaklaşımları tamamlamaktadır ve metabolik regülasyon anlayışı ilerletmek gerekir.
Introduction
Model organizma Drosophila melanogaster çalışma genetik ilkeleri, gelişim süreçleri, büyüme, yaşlanma, davranış, bağışıklık ve insan hastalığı 1,2 anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur. Drosophila genetik ve hücre biyolojik yaklaşımlar sayısız Bu alanlarda ilerleme sürdü. Bununla birlikte, meyve sineği metabolizma çalışması, daha yavaş gelişmiş bir küçük bir hayvan metabolik parametreleri ölçmek zorluklara büyük oranda yer alır. Diyabet gibi insan hastalıklarının araştırılmasında bir model olarak Drosophila kullanarak büyüme ve çeşitli patolojiler için metabolizma katkıları anlamak için ilgi geliştirmek ve bu organizma 3,4 metabolik teknikleri adapte alan itti.
Güvenilir yöntemler artık meyve sineğinin metabolik parametrelerin bir dizi ölçümü için kullanılabilir. Örneğin, gıda alımını değerlendirmek basittir <s> 5 kadar, depolanan trigliseridler ve glikojen, hem de glikoz dolaşımdaki hemolimf düzeyleri ve glukoz 4 iki molekül oluşan bir disakkarittir sinek, trehaloz, büyük sirkülasyon şeker seviyeleri. Metabolik izleyiciler kullanılması gibi depolama formları glikojen ve trigliserid 6 glukoz gibi diyet ve emilen besinlerin dönüşümünden besin emilimi çalışma sağladı. Metabolik oranları meyve oksijen tüketimi 7,8 ve karbondioksit ölçümü üzerinden uçmak (CO 2) üretiminde değerlendirilebilir. sitrik asit döngüsü, diyet ve depolanmış karbonhidrat ve yağ asitlerinin metabolizması türetilir asetil koenzim A (CoA) gibi döngüsü girebilir iki karbon birimleri okside eder. Döngüsünün her turlu bir GTP (veya ATP) her molekülü ve elektron donör FADH 2, NADH üç molekülleri ve atık ürün CO 2 iki molekülleri üretir. CO 2 üretimi canBazal metabolizma hızı tahmin etmek için kullanılabilir. Toplam CO2 üretimi ticari olarak temin edilebilen ya da el yapımı respirometers 9-10,11 kullanımı yoluyla Drosophila belirlenebilir.
Özellikle O 2 tüketimi ölçümü ile birleştiğinde, toplam CO2 üretiminin ölçümü, tüm vücut enerji metabolizmasında değerli bilgiler sağlar. Bununla birlikte, besin tanımlamaz bu önlem adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksitlenmektedir. karbonhidratlar, yağlı asitler ve proteinler: besin maddelerinin üç önemli sınıfı asetil CoA sitrik asit döngüsü, aşağıdaki dönüştürme girebilir. Glukoz-6-fosfat, diyet glukoz veya depolanan glikojen türetilen, asetil CoA oluşturur piruvat dehidrojenaz ile dekarboksile edilir piruvata dönüştürülebilir. daha sonra sitrik asit döngüsü girer asetil CoA SS-oksidasyon verimleri ile diyet veya hafızaya trigliseridlerden türetilen yağ asitlerinin dağılımı. En sonundaAmino asitlerin bir kısmı alfa-ketoglutarat CoA ya da sitrik asit döngüsü ara-asetil, piruvata dönüşümü takip sitrik asit döngüsü girebilir.
bazal ve uyarılmış koşullarında enerji metabolizması Besin özel katkı radyoaktif izleyiciler kullanılarak izlenebilir. Burada sunulan protokol kültür 12,13 yetiştirilen hücrelerde oksidasyon değerlendirmek için kullanılan bir protokol Drosophila kullanım için uyarlanmıştır. Bu yaklaşımda, meyve sinekleri beslenen 14C-radyo işaretli metabolik substratlar (karbonhidratlar, yağlı asitler ya da amino asit) kısa bir süre (saat) diyet ya da uzun süre (gün) darbe, etiketlenmemiş gıda takip ve sonra maruz bırakılmıştır odası bikarbonat gibi solunan CO2 yakalama için potasyum hidroksit (KOH) -saturated filtre kağıdı ihtiva etmektedir. Radyo-işaretli bikarbonat sintilasyon sayımı ile tayin edilebilir. Deney arasındaki radyo etiketli-CO2 üretimi farklılıklarsinekler ark grupları, örneğin genotip arasındaki yakıt metabolizmasında uzun bir hızlı veya içsel farkları boyunca ATP üretimi için farklı yakıt kullanımını yansıtabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, yetişkin Drosophila melanogaster spesifik radyo-etiketli substratlar oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntem tarif eder. Bu teknik, basit kantitatif, tekrarlanabilir ve hassas olduğunu ve bunun ATP üretimi için okside besin (ler) tanımlamak için kullanılabilir, çünkü toplam CO2 üretimi ve O 2 tüketimi ölçmek mevcut yöntemleri tamamlar.
Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, belirli radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda serbest CO2 ölçümü toplam CO2 üretimini ölçmek teknikleri tamamlayıcıdır. Toplam CO2 üretimi (V CO2) ve toplam O 2 tüketimi (V O2) bilindiği zaman, metabolizma hızı hesaplanabilir ve oksidasyon yakıt kaynağı solunum değişim oranına göre tahmin edilebilir (V metabolizma hızı tahmin edilebilir CO2 / V O2 = RER). Ne zamankarbonhidratlar özel alt tabaka, rer = 1, ama yağ asitleri özel kaynak, YEK = 0.7, glikoz ve lipit oksidasyon reaksiyonlarının stokiyometri nedeniyle zaman. Drosophila 14 oksijen tüketimini ölçmek için ekipman yokluğunda, oksidatif yakıt kaynağı tespit edilemez. Etiketleme iz bir radyoaktif substrat veya başka miktarları ve radyoaktif olarak işaretlenmiş CO2 üretimi ölçüm oranları ile uçar tarafından Ancak, bir uyaranın sırasında veya etkileri ile ilgili farklı zaman noktalarında belirli bir alt tabakayı okside sineklerin yeteneği hakkında sonuçlar çıkarabiliriz yakıt oksidasyonu üzerindeki mutasyon verilen.
Bu protokol kritik adımlar vardır. dökülmelerini ve araştırma alanlarının kirlenmesini önlemek için radyoaktif maddeleri kullanırken Birincisi, dikkatli olunmalıdır. Adımlarda 2.1 ve 3.4 sırasında sinekler anestezi İkincisi, deneyci uzun süreli CO 2 etkilerinden kaçınmak için hızlı bir şekilde çalışması gerekirmetabolizma ve davranışları üzerindeki poz. 20 sinek bir grup anestezi ve yeni bir şişeye ya da 20 saniye ya da daha az bir uçucu bölmesine aktarılabilir. Bir gıda flakon bir anestezi cihazının transfer olduğunda, şişe gıda yüzeyine yapışmış getting anestezi sinekler önlemek için, yan dinlenmiş olmalıdır. sinekler adım 2.2 olarak birkaç gün boyunca beslenen radyoaktif işaretli gıda olduğunda, deneyci sinekler dehidrasyon duyarlı gıda kurumasına olmadığını sigorta gerekir.
beslenen veya aç karnına önce etiketleme, etiketin seçimi, etiketleme süresi uzunluğu, uçucu bölmesinde süre ve anestezi yöntemi, bu yöntem kullanıldığında sorun giderme ve değişikliğe tabi tutulabilir parametrelerdir. (- 3 saat 2) önceden açlık süresi tabi olmadıkça radyoaktif işaretli gıda önemli miktarlarda tüketmek olası değildir Birincisi, kısa etiketleme dönemlerine tabi sinekler. Etiket c İkincisi, seçimBir tek metabolik fenotipleri hakkında çizebilir sonuçları etkiler. Örneğin, d-radyo işaretli CO2 üretimi [1- 14C] -glükoz, sitrik asit döngüsü ve pentoz fosfat şant vasıtasıyla oksidasyon yansıtabilir D- radyo işaretli CO2 üretimi ise [6- 14C] -glükoz oksidasyon yansıtır sitrik asit döngüsü boyunca sadece 12,15,16. Temel bir amino asit 17,18 için bir radyo-etiketli izleyici ile sinekler besleme proteinlerden türetilen amino asitlerin oksidasyonu değerlendirmek için bir strateji olabilir. Son olarak, radyo işaretli glukoz ile uzun etiketleme süreleri de trigliseritler 19 ve hali hazırda piruvat ile interconverts alanin gibi amino asitler gibi moleküllerin diğer sınıflarına Bu ön-maddesinin dahil olma ihtimalini artırır. Bu moleküllerin 6, bu farklı sınıflara dahil radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir. Gerçekten de, sinekler ayrı kohortlar beslenebilir radAynı şekilde alt tabakaların iolabeled ve daha sonra, örneğin, koşullar 6 saklanır ve beslenen glikojen ve trigliserid kalır ve aç bırakılmış olan uçucu bölmesi deneyler ya da radyo-ölçümü için de kullanılır. Başka bir strateji radyoaktif işaretli diyet besin oksidasyonunu kendileri ve bu besinlerin değil depolama biçimlerini ortaya çıkarmak için muhtemel kısa etiketleme dönemlerini kullanmaktır. Üçüncü olarak, sinekler iki grup, ilk zaman belirli bir miktar üzerinden 14 CO 2 üretimi benzer oranları, ama çok farklı oranlarda sahip olabilmesi de mümkündür. Bu nedenle, sinek bölmesine harcamak uçar süreyi değişen fenotipik varyasyon değerlendirirken değiştirmek için önemli bir parametre olabilir. Son olarak, bu protokol CO 2 anestezi sinek pod cihazı içine sinekler koyarak kısa bir süre kullanımı için çağırır. CO 2 anestezi sinek pod deney boyunca metabolik fonksiyonu etkileyebilir mümkündür. Alternatif birpproach metabolizma hızı 20 etkilemez azot anestezi kullanmaktır.
Yakıt oksidasyon ve metabolizma hızı gibi karmaşık bir sistemi ölçen herhangi tekniği ile olduğu gibi, burada anlatılan yöntem sınırlamaları vardır. Birincisi, alt tabakanın farklı başlangıç miktarları ile testinin CO2 toplama safhasına girecek ve böylece radyoaktif işaretli gıda farklı miktarlarda tüketmek olabilir farklı gruplarda uçar ve mümkündür. Bu büyük örneklem büyüklüğü ile deney yaparak ve topluca sinekler beslenerek bir ölçüde kontrol edilebilir. benzer mavi renkli bağırsaklar radyoetiket tüketilen ve deney kovalamaca kısmına taşınabilirler kısa etiketleme süreler için, uçar. sinekler grupta geri kalan radyo-miktarı da deneyin sonunda ve besleme ve ilk takip süresinin sona ermesinden sonra sinekler ayrı gruplar halinde ölçülebilir. arasında ikinci, aktivite düzeylerisinek bakla sinek grupları farklı olabilir. Bu deneysel olarak belirlenen ve veri yorumlanırken dikkate alınması gerekecektir. Üçüncü olarak, bu teknik, toplam CO2 üretimi, belirli bir beslenme besin veya besin depolama form (lar) sadece üretimini ölçmek değildir. Bu protokol için bir yedek değil ama farklı ve ek bilgi sağlar, çünkü yerine VCO 2 ölçümlerine tamamlayıcıdır.
Burada tarif edilen yöntem, belirli bir metabolik maddelerin eser miktarlarda oksidasyon ürünü olan, radyo-etiketli CO2 nefes verme ölçer. glikoz, yağ asitleri, ya da amino asit – – kullanılan etiket değiştirerek tarafından böyle bir açlık olarak ve farklı genetik geçmişleri farklı fizyolojik koşullar altında metabolizma farklı yüzeylerde katkılarını değerlendirmek için giderek sofistike deneyler tasarlayabilirsiniz. Bu tekniğin gelecekte uygulamaları metabolis ölçülmesini içerirgelişme larva ve pupa aşamaları sırasıyla besin depolama ve arıza, aşırı ile karakterize edilir Drosophila yaşam döngüsü, iki kademeli m.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
Referencias
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genética. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
