Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em> Хеликобактерной</em> Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em> Кишечная палочка</em> В пакетном режиме

Helicobacter Pylori (H.) является основной причиной гастрита и язвенной болезни. Эта бактерия также классифицируется как канцероген в организме человека Международным агентством по изучению рака, часть Всемирной организации здравоохранения, в 1994 году было подсчитано , что распространенность H. инфекции пилори составляет 70% в развивающихся странах и на 30-40% в промышленно развитых странах ^1. Даже при том , что уровень инфицированности H. пилори снижается в промышленно развитых странах, уровень инфицированности H. пилори в развивающихся странах по – прежнему высок ^2. Стандартное лечение искоренить H. Инфекция пилори состоит из введения ингибитора протонной помпы, ИПП и двух антибиотиков, кларитромицин плюс амоксициллин или метронидазол ^3. Тем не менее, повышение резистентности к антибиотикам у H. пилори терапия язвенной болезни о связанных настоятельно призывает к разработке новых стратегий по предотвращению Oг вылечить инфекцию. Разработка профилактических и / или терапевтической вакцинации против H. пилори может обеспечить альтернативный подход к контролю H. пилори инфекции.

Хеликобактерной активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP), одним из основных факторов вирулентности пилори H, был впервые выявлен в водных экстрактов H. пилори с возможностью активировать нейтрофилы придерживаться эндотелиальных клеток и производят активные формы кислорода (ROS) ^4. Нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки желудка обнаружено в H. pylori- инфицированных пациентов с активным гастритом может привести к воспалению и повреждению тканей желудка. Таким образом, НР-NAP может играть патологическую роль при активации нейтрофилов , чтобы вызвать воспаление желудка, которое вызывает дальнейшее язву или Н. пилори -associated заболеваний желудка. Тем не менее, НР-NAP является потенциальным кандидатом для клинического применения ^5,6. В связи с иммуногенной и иммуномодулирующим проperties НР-NAP, этот белок может быть использован для разработки вакцин, терапевтических средств и диагностических инструментов. Клиническое исследование было проведено с использованием рекомбинантного для HP-NAP в качестве одного из компонентов белковой вакцины против H. пилори. Эта вакцина состоит из рекомбинантного HP-NAP, цитотоксин-ассоциированный ген (CagA) и вакуолизирующий цитотоксин А (VacA) белков , сформулированного с гидроксидом алюминия и далее было показано , что безопасность и иммуногенность у человека ^7. Кроме того , НР-NAP действует как мощный иммуномодулятор , чтобы вызвать Т – хелперов типа 1 (Th1) -поляризованым иммунные ответы для лечения рака ⁸ и вниз регулировать Th2-опосредованные иммунные реакции , индуцируемые аллергических реакций и паразитарных инфекций ^9,10. Что касается диагностики, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , был применен для выявления антител сыворотки против HP-NAP в H. пилори -infected пациентов ^11. Одно исследование показало , что уровень HP-NAP-специфических антител в сыворотке крови от H. PYLori -infected пациентов с раком желудка была достоверно выше , чем у пациентов с хроническим гастритом ^12. Другое исследование также показало , что сывороточные антитела против HP-NAP связаны с наличием не-кардии аденокарциномы желудка ^13. Таким образом, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , может быть применен для определения сывороточных антител против HP-NAP для прогноза рака желудка в H. пилори -infected пациентов. Взятые вместе, очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Среди нескольких методов , используемых для очистки рекомбинантного HP-NAP выражается в Escherichia coli (E.coli) в своей нативной форме сообщалось до сих пор, необходим второй этап очистки с участием гель-фильтрационной хроматографии с получением высокочистого НР-NAP ^14-16 , При этом способ с использованием негативного режима пакетной хроматографии сдиэтиламиноэтил (DEAE) ионообменные смолы описана для очистки HP-NAP сверхэкспрессируется в E. палочка с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Этот метод очистки был основан на связывании белков клетки-хозяина и / или других, чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков, кроме HP-NAP извлекают из несвязанной фракции. Такая очистка подход с использованием DEAE ионообменной хроматографии в отрицательном режиме проста и экономии, позволяя очистку рекомбинантного HP-NAP с помощью одностадийной хроматографии путем сбора несвязанной фракции времени. В дополнение к HP-NAP, несколько других биомолекул, таких как вирусы ^17, иммуноглобулин G (IgG) , ^18, ​​гемоглобин ^19, протеинфосфатазы ^20, и фактор вирулентности флагеллином ^21, также , как сообщалось, очищают с помощью ионообменной хроматографии в негативном Режим. Отрицательный режим является предпочтительным для ионообменной хроматографии, если примеси являются незначительнымикомпоненты , присутствующие в образце , подвергнутого быть очищено ^22. Применение отрицательной хроматографии в очистки природных или рекомбинантных биомолекул был недавно рассмотрен ^23.

В настоящем докладе дается шаг за шагом протокола для экспрессии рекомбинантного HP-NAP в E. палочка, лизис клеток и очистки HP-NAP с использованием негативного режима пакетной хроматографии с DEAE ионообменных смол. Если белок желательно для очистки пригоден для ионообменной хроматографии в отрицательном режиме, описанный протокол также может быть адаптирована в качестве отправной точки для разработки способа очистки.