Eine hohe Ausbeute Verfahren zur einstufigen negativen Reinigung von rekombinanten Helicobacter pylori de Escherichia coli Neutrophile aktivierendes durch Verwendung Diethylaminoethyl Harze im Batch – Modus überexprimiert Protein (HP-NAP) beschrieben ist. HP-NAP durch dieses Verfahren gereinigt ist vorteilhaft für die Entwicklung von Impfstoffen, Medikamente oder Diagnostika für H. pylori -assoziierte Krankheiten.
Helicobacter pylori Neutrophilen-aktivierendes Protein (HP-NAP) ist ein wichtiger Virulenzfaktor von Helicobacter pylori (H. pylori). Es spielt eine entscheidende Rolle in H. pylori induzierte Magenentzündung durch verschiedene angeborene Leukozyten einschließlich Neutrophile, Monozyten und Mastzellen aktiviert werden . Die immunogene und immunmodulatorische Eigenschaften von HP-NAP machen es zu einem möglichen diagnostischen und Impfstoffkandidaten für H. pylori und ein neuer Medikamentenkandidaten für die Krebstherapie. Um erhebliche Mengen an gereinigtem HP-NAP für seine klinische Anwendung, ein effizientes Verfahren dieses Protein mit hoher Ausbeute und Reinheit zu erhalten, verwendet zu reinigen eingerichtet werden muss.
In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur einstufigen negativen chromatographischen Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in Escherichia coli (E. coli) unter Verwendung von Diethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen beschrieben (z. B. Sephadex) in Batch-Modus. Rekombinante HP-NAP bildet fast 70% des Gesamtproteins in E. coli und wird nahezu vollständig in der löslichen Fraktion nach Zelllyse bei pH 9,0 gewonnen. Unter der optimalen Bedingung bei einem pH von 8,0, wird der Großteil der HP-NAP in der ungebundenen Fraktion gewonnen , während die endogenen Proteine aus E. coli effizient durch das Harz entfernt.
Dieses Reinigungsverfahren unter Verwendung von negativen Modus batch – Chromatographie mit DEAE – Ionenaustauschharze ergibt funktionelle HP-NAP aus E. coli in seiner nativen Form mit hoher Ausbeute und Reinheit. Das gereinigte HP-NAP könnte weiter zur Verhütung, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist eine Hauptursache von Gastritis und Magengeschwüren. Dieses Bakterium ist auch als Karzinogen beim Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung, Teil der Weltgesundheitsorganisation im Jahr 1994 eingestuft Es wurde geschätzt , dass die Prävalenz von H. pylori – Infektion ist 70% in den Entwicklungsländern und 30-40% in den Industrieländern 1. Auch wenn die Infektionsrate von H. pylori wird in den Industrieländern abnimmt, die Infektionsrate von H. pylori in den Entwicklungsländern ist 2 immer noch hoch. Die Standardbehandlung H. auszurotten pylori – Infektion besteht aus der Verabreichung eines Protonenpumpenhemmers, PPI, und zwei Antibiotika, Clarithromycin und Amoxicillin oder Metronidazol 3. Allerdings ist der Anstieg der Antibiotikaresistenz in der H. pylori verwandtes Geschwür Therapie die Entwicklung neuer Strategien drängt o zu verhindernr die Infektion zu heilen. Entwicklung von präventiven und / oder therapeutischen Impfung gegen H. pylori könnte einen alternativen Ansatz bieten H. zu steuern pylori – Infektion.
Neutrophilen-aktivierende Protein Helicobacter pylori (HP-NAP), ein wichtiger Virulenzfaktor von H pylori, wurde zuerst in Wasserextrakten von H. identifiziert pylori mit der Fähigkeit , Neutrophile zu aktivieren , um an endotheliale Zellen anheften und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 4 herzustellen. Neutrophile Infiltration der Magenschleimhaut in H. gefunden pylori – infizierten Patienten mit aktiver Gastritis kann bei der Entzündung und Gewebeschädigung des Magens führen. So Neutrophilen eine pathologische Rolle spielen , indem sie die Aktivierung HP-NAP kann eine Magenentzündung zu induzieren, die weiter Geschwür oder H. verursacht pylori -assoziierten Magenerkrankungen. Dennoch ist HP-NAP ein potentieller Kandidat für die klinische Anwendung 5,6. Aufgrund der immunogene und immunmodulatorische Proschaften von HP-NAP könnte dieses Protein verwendet werden, um Impfstoffe, therapeutische Mittel und Diagnose-Tools zu entwickeln. Eine klinische Studie wurde unter Verwendung von rekombinantem HP-NAP als eine der Komponenten eines Proteins Impfstoff gegen H. durchgeführt pylori. Dieser Impfstoff besteht aus rekombinanten HP-NAP, Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) und vacuolating cytotoxin A (VacA) Proteine mit Aluminiumhydroxid formuliert und hat sich weiter beim Menschen sicher und immunogen zu sein 7 gezeigt. Auch wirkt HP-NAP als ein potenter Immunmodulator T – Helfer Typ 1 (Th1) -polarisierte Immunantworten für die Krebstherapie 8 und nach unten zu regulieren Th2-vermittelte Immunreaktionen durch allergische Reaktionen und parasitäre Infektionen 9,10 ausgelöst auszulösen. Wie für die Diagnostik, wurde Serum – Antikörper gegen HP-NAP in H. zu erkennen rekombinanten HP-NAP-basierten ELISA angewendet pylori – infizierten Patienten 11. Eine Studie zeigte , dass der Pegel des HP-NAP-spezifische Antikörper in Seren von H. pylori -infizierten Patienten mit Magenkrebs als die 12 von Patienten mit chronischer Gastritis signifikant höher war. Eine andere Studie zeigte auch , dass Serumantikörper gegen HP-NAP mit der Anwesenheit von nicht-Cardia Adenokarzinom des Magens 13 verbunden sind. So können rekombinante HP-NAP-basierten ELISA Serum – Antikörper gegen HP-NAP für die Prognose von Magenkrebs in H. zu erkennen , anzuwenden pylori – infizierten Patienten. Zusammengenommen können das gereinigte HP-NAP weiter für die Prävention, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie.
Unter den verschiedenen zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP Methoden exprimiert in Escherichia coli (E. coli) in seiner nativen Form berichtet so weit, einem zweiten Reinigungsschritt beteiligt Gelfiltrationschromatographie hochreines HP-NAP zu erhalten , ist erforderlich 14-16 . Hier wird ein Verfahren unter Verwendung von negativen Modus batch-Chromatographie mitDiethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen wird zur Reinigung von HP-NAP beschrieben überexprimiert in E. coli mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit. Dieses Reinigungsverfahren wurde auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0, fast keine andere Proteine außer HP-NAP werden aus der ungebundenen Fraktion gewonnen. Diese Reinigung Ansatz unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in negativen Modus ist einfach und zeitsparend durch Reinigung von rekombinantem HP-NAP über Einstufen-Chromatographie durch die Erhebung von der ungebundenen Fraktion ermöglicht. Neben HP-NAP mehrere andere Biomoleküle, wie beispielsweise 17 Viren, Immunoglobulin G (IgG) 18, Hämoglobin 19, Proteinphosphatase 20 und Virulenzfaktor Flagellin – 21, wurden auch durch Ionenaustauschchromatographie zu reinig in negativer berichtet Modus. Der negative Modus wird für die Ionenaustauschchromatographie bevorzugt, wenn die Verunreinigungen gering sindvorhandenen Komponenten in der Probe unterzogen , bis 22 gereinigt werden. Die Anwendung der negativen Chromatographie bei der Reinigung von natürlichen oder rekombinanten Biomoleküle wurde 23 vor kurzem überprüft.
Der vorliegende Bericht liefert eine Schritt für Schritt – Protokoll für die Expression von rekombinanten HP-NAP in E. coli, Lyse der Zellen und die Reinigung von HP-NAP unter Verwendung von negativen Modus batch – Chromatographie mit DEAE – Ionenaustauschharze. Wenn ein Protein für die Reinigung erwünscht für Ionenaustauschchromatographie in Negativmodus geeignet ist, könnte das beschriebene Protokoll auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Reinigungsverfahrens angepasst werden.
Die negativen Modus batch – Chromatographie mit DEAE Anionenaustauscherharze präsentierten zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in E coli geeignet. Die pH – Werte der Puffer in den Schritten der Zell – Lyse und Reinigung verwendet werden , sind sehr kritisch , um die Löslichkeit von HP-NAP in E. , um sicherzustellen , coli – Lysaten und effiziente Trennung von rekombinantem HP-NAP von Wirtszellverunreinigungen, respectively. Bakterielle Zellen sollten bei einem pH von 9,0, …
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Material | |||
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Name | Company | Product Number | Comments |
Equipment | |||
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Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
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Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |