L'injection de cellules syngéniques murin de mélanome pour déterminer leur potentiel métastatique dans les Poumons

Déclaration d'éthique: L'utilisation de la souris dans la recherche est acceptable dans les cas où il pourrait faire avancer la compréhension humaine de la biologie fondamentale ou vers le traitement éventuel de la maladie. 1. Commande Achat femelle C57BL / 6 (âgés de 6 – 8 semaines), 5 souris par groupe. Autoriser plusieurs jours pour les souris pour ajuster. 2. Préparation des cellules B16-BL6 Retirer les plaques de culture de cellules de l'incubateur 37 degrés et dans une hotte stérile. Les plaques doivent être d'environ 70% de confluence avec des cellules de mélanome murin B16-BL6. Une plus grande confluence peut modifier les cellules potentiel métastatique. Ajouter 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA par plaque, laisser reposer pendant 1 min, puis aspirer la solution trypsine-média. Ajouter 1 ml de trypsine par plaque et retourner des plaques dans l'incubateur pendant 10 min. Après avoir déplacé les plaques de l'incubateur à la hotte stérile, ajouter 4 ml de sans sérum Rosewell Memorial Park Institute Medium (RPMI) à chaque plaque. Recueillir les cellules avec une pipette motorisée stérile. Ejecter cellules contre le fond de la plaque, avec la pointe appuyée à un très léger angle, pour briser les cellules. Répéter plusieurs fois afin d'assurer une séparation adéquate des amas cellulaires, qui pourraient sinon boucher l'aiguille d'éjection. Rappeler et transférer dans un tube conique de 50 ml. Utiliser un hématimètre pour déterminer la densité cellulaire. Garder le nombre total de cellules B16-BL6 constante, déterminer le volume de RPMI sans sérum nécessaire pour atteindre des concentrations finales de 0, 0,065, 0,015, 0,25, et 0,5 millions de cellules / ml. aliquoter De même, les médias dans le tube de 50 ml à 15 ml tubes coniques. Centrifuger les tubes coniques à 2250 xg pendant 5 min. Décanter les médias. Ajouter un volume approprié de RPMI sans sérum et confirmer la densité cellulaire souhaitée via hématimètre. Ajuster densities- par adjonction supplémentaire RPMI ou le filage et la remise en suspension dans un volume- plus petit en conséquence. Aliquoter 500 pide chaque suspension cellulaire dans 1,8 ml marqués tubes sur la glace. 3. veine de la queue d'injection Prenez une souris, tenue par la queue, et la guider arrière d'abord dans le restrainer de la souris. Avec le torse dans la chambre principale de la restrainer, avec la queue à l'extérieur, tirez la souris vers la fin de la restrainer. Insérez le restrainer-plongeur, en continuant à pousser jusqu'à ce que la souris est sécurisé. Faire tourner la souris 90 degrés de telle sorte que l'une des nervures latérales de la queue est tournée vers le haut. L'utilisation d'un tampon imbibé d'alcool, nettoyer vigoureusement le côté de la queue de la souris, en particulier lorsque la veine de la queue est la plus visible. Remarque: Un bon éclairage est essentiel pour la queue efficace veine visualisation sur B57BL / 6J. Des lampes chauffantes ou des tampons de chirurgie chauffée, tandis que pas nécessaire, aideront aussi en augmentant le volume de la veine de la queue. Dans une hotte de culture stérile, la collecte 300 pi de milieu de culture cellulaire à partir de la 2 millions de cellules / ml tube. Inversez l'aiguille, effleurant les side et poussant le piston pour éjecter les bulles de la seringue. Éjecte culture RPMI pour donner un volume final de 250 ul. Etendre la souris-queue avec la main non dominante. Tenir la queue à l'extrémité proximale de la queue élevée avec l'index de la main non dominante, et la partie distale de la queue enfoncée avec le pouce. Remarque: De cette manière, la veine de la queue est maintenue dans une position latérale, parallèle à la surface du dispositif de retenue, avec une entrée congruentes possible dans la partie la plus distale de la queue. Insérez l'aiguille dans la veine de la queue, vers l'extrémité distale, à un angle vers le bas minute pour commencer, puis ajuster l'aiguille pour correspondre à l'angle de la veine de la queue à la poursuite de l'insertion (abaissement extrémité du piston de la seringue par rapport à l'aiguille) . Insérez l'aiguille d'environ 1 cm dans la veine de la queue. Après l'insertion, commencer à pousser le piston, tenant l'aiguille stable. Remarque: Si l'aiguille est dans la veine de la queue et l'extrémité de l'aiguille est un groupe not obstrué les médias devraient circuler librement dans la veine. injection efficace est caractérisée par la clairance de sang de la veine. En cas de résistance, ou une bulle commence à se former sur le site de l'injection, retirez l'aiguille et essayez à nouveau à un endroit plus proximal le long de la veine de la queue. Retirez l'aiguille de la veine et le jeter. Maintenez la gaze contre le site d'entrée pour arrêter le saignement. Retirer le piston de la restrainer et placez la souris dans la cage du destinataire. Répétez l'opération pour toutes les autres concentrations. Remarque:. Lung établissement foyers prend environ 2 – 3 semaines, avec une variabilité en fonction de la lignée cellulaire et la taille souhaitée des foyers 9 Dans l'intervalle, les souris doivent être surveillés pour des symptômes qui pourraient justifier l' euthanasie précoce, comme halètement excessif. 4. Compter le poumon Foci Euthanize la souris en plaçant dans une chambre de CO 2 et l' exposition à 100% de CO 2 </sub> introduit à 10-30% du volume de la chambre par minute pendant 5 minutes. Suivez avec une dislocation cervicale. Splay la souris sur styromousse. Avec des ciseaux chirurgicaux, créer une incision chirurgicale le long du sternum. Faire deux incisions supplémentaires, à la fois par le haut de l'incision du sternum et la ramification vers les épaules de la souris, l'exposition de la cage thoracique. Faites deux coupes, chacun le long des côtés latéraux du sternum, pour enlever la cage thoracique du torse, ce qui expose les poumons et le cœur. En tenant le coeur avec des pincettes chirurgicales, couper l'œsophage et la trachée, ce qui libère le cœur et les poumons de la souris. Placer sous un microscope à dissection, au grossissement 10X, pour une meilleure visualisation. Disséquer le coeur des poumons et retirer le thymus, ne laissant que les deux poumons. Avec les poumons sous un champ de dissection, commencer à compter les foyers du poumon. Chaque foyers doit apparaître comme une circulaire, brun intrusion sur la surface des poumons. Pourla cohérence entre les souris, compter le nombre de foyers sur la surface d'un lobe, puis inverser ce lobe. Faire chacun des quatre lobes permet individuellement pour faciliter le comptage. Enregistrer et fixer les poumons si la procédure IHC, sinon, jetez les restes.