약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 상피 세포가 중간 엽에 transdifferentiating의 과정을 설명합니다. EMT는 또한 일반적으로, 아교 모세포종에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 발생 배아 개발하는 동안 기본 과정이다. EMT는 유방암, 폐암, 대장 암, 위암을 포함하는 뇌 밖에 여러 암에서 관찰되었다. EMT 중앙 이동, 침윤 및 전이 형성을 촉진하여 악성 종양에 연결되어 있습니다. EMT 유도의 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 여기에서 우리는 대뇌 피질의 신경 줄기 세포 (NSCs을) 이후 EMT 유도의 표준화 분리에 대한 체외 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 하나의 세포 이식편의 배양을 사용하는 유연성을 제공한다. 이 시스템에서, 래트 또는 마우스 배아 NSCs의 전뇌는 한정 배지에서 배양하여 혈청 효소의 결여이다. NSCs의는 oligodendroc에서 관찰 Olig2 및 Sox10, 두 개의 전사 인자를 표현YTE 전구 세포 (개 OPC). 이 시스템을 사용하여, FGF-, BMP- 사이의 상호 작용 Zeb1, Zeb2을 포함하는 TGFβ는-신호 및 Twist2는 TGFβ 활성화가 크게 상승 BMP- / TGFβ 상호 작용을 제안, 세포 이동을 강화 여기서 관찰되었다. 결과 EMT 유도 및 유지에 관여하는 것으로 FGF-, BMP- 및 TGFβ-시그널링 네트워크 가리. 이 모델 시스템은 시험 관내에서 EMT를 조사 관련이있다. 그것은 비용 효율적이고 높은 재현성을 보여줍니다. 또한, 그 이전의 응답에 대한 (정량적 거리 측정)을 억제하거나 EMT (정량적 측정)을 향상시키기 위해 화합물의 높은 처리량 스크리닝과 상이한 화합물의 비교를 허용한다. 이 모델은 따라서 잘 EMT에 영향을 미치는 물질 약물 라이브러리를 테스트하는 데 적합합니다.
Introduction
배아 발달의 여러 단계 동안, 상피 세포가 서로 (예를 들어, 꽉 접합)에 강한 준수를 잃고 중간 엽 전이 (EMT) 1 과정이라고 상피의 철새 표현형을 획득. EMT는 같은 간엽 세포 신경 능선 부가적인 세포 유형의 형성 상기 (2)로부터 neuroepithelium 편석 인구 요구된다. EMT는 배아 단계 동안 만 중요하지만 병변 4 탈수 초성 이러한 상처 치유 (3) 및 중추 신경계 (CNS)와 재생 성인 유기체의 생리 학적 과정을 유지할 성인기 이후 단계에서 요구되지 않는다.
상피 종양은 궁극적으로 암의 진행 1,3로 이어지는, 이동, 침윤 및 전이에 대한 개시 단계로 EMT를 활성화하는 것으로 알려져있다. EMT는 참으로 중앙에서 강력한 마이그레이션 1,3에 연결되어 있습니다. C의 세포 단계onditioning, 시작 겪고 및 EMT를 유지 완전히 이해하고 추가 조사가 필요하지 않습니다.
여기서, 정의 된 성장 인자와 미디어 (NO 혈청 효소없이 사용)와 NSCs을 기반으로하는 표준 시험 관내 EMT 모델 시스템이 제공된다. 이 모델 시스템은 EMT 작업 과학자 관련이있다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질 가족 모두 개발 및 질병 1 EMT에 중요한 것으로 나타났다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 가족도 제공 시스템에 참여하고 있습니다. 이 시스템은 일반적으로는 EMT EMT 유도시 초기 사건의 연구에 특정 이점을 제공받지 않는 전뇌의 특정 영역에 기초한다.
같은 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질과 같은 키 EMT의 유도가, 또한 CNS 외부 조직 시스템에서 EMT에서 발견되기 때문에 모델 시스템은 잠재적으로, 중추 신경계 외부 상피 세포의 EMT 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 모델의템은 특히 줄기 세포의 일반적 특징과 EMT을 연구 개발 피질에서 NSCs을의 표준화 분리 할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 NSCs의 절연 유도 EMT 및 FGF2 및 BMP4의 영향 하에서 후속 이동을 연구 하였다. 우리는 FGF-따라서 모델 시스템의 유효성을 검사, 세포의 이동을 촉진하는 TGFβ가-신호와 상호 작용을 BMP는-신호 관찰.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMT 분석을 활용 NSCs을위한 표준화 된 시스템이 설명이 연구에서 (보충 그림 3에 요약). 표준화 재현성 (표 1 및 2)을 보장한다. NSCs의는 개발 피질에서 일반적으로 EMT를 받아야하지 않는 조직을 파생됩니다. 이 EMT 초기 단계의 분석을 위해 유리하다. EMT의 초기 단계는 적절하게 유전 적 변화를 축적하고 이미 EMT 기능을 채택하고있다 종양 세포에서 공부 할 수 없습니다. 또한…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 MHS와 AG (SNF IZLIZ3_157230)에 부여하여 바젤 과학 재단의 대학과 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다. 우리는 감사 : 박사 타니아 리 날디 Burkat을 아낌없이 인프라를 제공하기 위해; 토론과 의견에 대한 Bettler 그룹의 모든 구성원. 우리는 게르하르트 Dorne (라이카, 스위스) 풀 HD MC170 비디오 카메라의 전문적이고 유능한 설치 (라이카, 스위스) 감사합니다.
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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