This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
Optische super-resolutie beeldvorming met gestructureerde verlichting microscopie (SIM) is een belangrijke technologie voor de visualisatie van processen op moleculair niveau in de chemische en biomedische wetenschappen. Hoewel commerciële SIM systemen zijn systemen die op maat zijn ontworpen in het laboratorium commerciële systemen beter presteren dan deze eigenlijk ontworpen voor gebruiksgemak en algemene toepassingen, zowel qua beeldvorming betrouwbaarheid en snelheid. Dit artikel geeft een uitgebreide gids voor het opbouwen van een SIM dat gebruik maakt totale interne reflectie (TIR) verlichting en kan imaging up to 10 Hz in drie kleuren met een resolutie van 100 nm. Door de combinatie van SIM en TIRF, het systeem beter beeldcontrast dan concurrerende technologieën. Om deze specificaties te bereiken worden verschillende optische elementen die gebruikt worden om automatische controle over de polarisatietoestand en de ruimtelijke structuur van de verlichting licht mogelijk te maken voor alle beschikbare excitatie wavelengths. Volledige details over de hardware-implementatie en controle worden gegeven aan synchronisatie tussen excitatielicht patroon generatie, golflengte, polarisatie staat, en de camera controle te bereiken met de nadruk op het bereiken van maximale overname frame rate. Een stap-voor-stap protocol voor het systeem uitlijnen en kalibratie wordt gepresenteerd en de haalbare verbetering resolutie gevalideerd op ideale testmonsters. De mogelijkheid om video-rate super-resolutie beeldvorming wordt gedemonstreerd met levende cellen.
In de afgelopen halve decennium heeft super-resolutie microscopie gerijpt en verhuisde van gespecialiseerde optica labs in de handen van de bioloog. Commerciële microscoop oplossingen bestaan voor de drie belangrijkste varianten voor het bereiken van de optische super-resolutie: enkel molecuul localisatie microscopie (SMLM), gestimuleerde emissie uitputting microscopie (STED), en gestructureerde verlichting microscopie (SIM) 1,2. SMLM zoals Photoactivated Localization Microscopy (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (Storm) hebben de meest populaire technieken geweest, grotendeels te danken aan de eenvoud van de optische opstelling en de belofte van hoge ruimtelijke resolutie, gemakkelijk tot 20 nm. Maar super-resolutie microscopie via single molecule lokalisatie wordt geleverd met een intrinsieke trade-off: de ruimtelijke resolutie haalbaar is afhankelijk van het verzamelen van een voldoende aantal individuele fluorofoor lokalisaties, vandaar beperking in de tijd resolutie. Imaging dynamisch proceses in levende cellen wordt derhalve problematisch als een voldoende beweging van de structuur van belang bewegingsartefacten voorkomen terwijl het verwerven genoeg lokalisatie gebeurtenissen in die tijd om een beeld te reconstrueren moeten proeven. Om aan deze eisen te voldoen, zijn levende cellen SMLM demonstraties de vereiste toename fluorofoor photoswitching tarieven verkregen door aanzienlijke verhoging van de excitatie energie, en dit leidt weer tot fototoxiciteit en oxidatieve stress, waardoor monster overlevingstijden en biologische relevantie 3 beperkt.
Een duidelijk voordeel van STED over zowel SIM-kaart en SMLM is dat het kan afbeelding met super-resolutie in dikke monsters, bijvoorbeeld laterale resolutie van ongeveer 60 nm werd bereikt in organotypische brain slices tot een diepte van 120 pm 4. Imaging op zo'n diepte met één doel implementaties van SMLM of SIM is niet haalbaar, maar wordt mogelijk met zowel single-molecule licht plaat of rooster licht blad microscopy 5. Video-rate STED is ook aangetoond en gebruikt om synaptische vesikel mobiliteit kaart, hoewel dit tot nu toe beperkt tot kleine gezichtsveld 6 beeldvorming.
Voor toepassingen in de celbiologie en zelfassemblage reacties moleculaire 7-12 die beeldvorming met hoge tijdsresolutie gedurende vele tijdstippen vereisen gestructureerde verlichting microscopie (SIM) kan geschikt als het is niet afhankelijk van de fotofysische eigenschappen van een bepaald fluorescentie sonde. Desondanks inherent voordeel van SIM, tot nu toe het gebruik ervan is voornamelijk beperkt tot gefixeerde cellen of langzaam bewegende processen beeldvorming. Dit komt door de beperkingen van commercieel beschikbare SIM systemen: het verwerven framesnelheid van deze instrumenten beperkt door de rotatiesnelheid van de rasters gebruikt om de vereiste sinusvormige verlichtingspatronen en de polarisatie optiek handhaven genereren. De nieuwste generatie van commerciële SIMinstrumenten zijn in staat om snel imaging, maar ze zijn onbetaalbaar om alle, maar de centrale imaging faciliteiten.
Dit protocol geeft een indicatie voor de bouw van een flexibel SIM voor het afbeelden snelle processen in dunne monsters en nabij het basale oppervlak van levende cellen. Er werken in totaal interne reflectie fluorescentie (TIRF) om een verlichting patroon dat niet dieper dan ongeveer 150 nm in de steekproef 13 die sterk vermindert de achtergrond van de focus signaal doordringt te genereren. Het idee van het combineren SIM met TIRF is bijna zo oud als SIM zelf 14 maar niet experimenteel gerealiseerd vóór 2006 15. Eerste in vivo verkregen beelden met TIRF-SIM werden gerapporteerd in 2009 16 bereiken beeldfrequenties van 11 Hz tot tubuline en kinesine visualiseren dynamiek, en twee kleuren TIRF-SIM-systemen zijn gepresenteerd 17,18. Meest recent, een gids voor de bouw en het gebruik van een enkele kleur twee-beam SIM system werd gepresenteerd met frame rates tot 18 Hz 19,20.
De set-up hier gepresenteerde kan SIM superresolutie imaging op 20 Hz in drie kleuren, waarvan er twee worden gebruikt in TIRF-SIM. Het gehele systeem is opgebouwd rond een omgekeerde microscoop frame en gebruikt een gemotoriseerde xy translatietrap met een piëzo-Z platform. De sinusvormige excitatiepatronen vereist TIRF-SIM genereren het gepresenteerde systeem maakt gebruik van een ferroelektrische ruimtelijke lichtmodulator (SLM). Binaire raster patronen worden op de SLM en de resulterende ± 1 ordes van diffractie worden gefiltreerd, geconcentreerd en doorgegeven in de TIR ring van de objectieflens. De noodzakelijke faseverschuivingen en rotaties van de roosters worden aangebracht door het weergegeven beeld SLM veranderen. Dit protocol beschrijft hoe te bouwen en af te stemmen zo'n excitatie pad, worden de uitlijning van de emissie-pad, en presenteert de monsters voor een optimale afstemming. Het ook De schriftgeleerden de problemen en uitdagingen het bijzonder op hoge snelheid TIRF-SIM over polarisatie controle en synchronisatie van componenten.
Ontwerp Overwegingen en beperkingen
Voor montage van de TIRF SIM-systeem in dit protocol, zijn er verscheidene ontwerpbeperkingen overwegen, die keuze van optische componenten te bepalen. Alle afkortingen van optische componenten zie figuur 1.
Ruimtelijke lichtmodulator (SLM)
Een binaire ferroelektrische SLM wordt in deze opstelling als het in staat is een milliseconde patroon schakelen is. Grijstinten nematische SLM kan worden gebruikt, maar deze bieden sterk verminderd schakeltijden. Elke in- of uitschakelen pixel in een binaire fase SLM zal verlenen of een π of 0 faseverschuiving om de invallende vlakke golffront, dus als een periodiek raster patroon wordt op de SLM zal werken als een fase-diffraktieraster.
ent "> totale interne reflectie (TIR)TIR bereiken en produceren een verdwijnende veld, moet de invalshoek van de excitatie stralen bij de glas-monsterscheidingsvlak groter dan de kritische hoek te . Dit stelt de minimale invalshoek vereist, en dus ook de maximale afstand, of periode van de verdwijnende verlichting patroon. De maximale invalshoek (De acceptatiehoek) wordt beperkt door de numerieke apertuur (NA) van de objectieflens die berekend kan worden uit de definitie . Dit bepaalt de minimale patroon haalbare afstand aan aan de Abbe formule die NA en de golflengte koppelt tot het minimum patroon afstand <imgalt = "Vergelijking" src = "/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg" />. In de praktijk, een 1,49 NA olie-immersie objectief TIRF levert een maximale invalshoek van ongeveer 79 ° en een minimale patroonperiode op het monster van 164 nm met een excitatie golflengte van 488 nm. Deze twee hoeken definiëren een ring aan de achterkant apertuur van het objektief waarover het instrument bereikt TIR verlichtingssterkte (dwz. De TIR ring) en waarin de twee brandpunten excitatie nauwkeurig worden gepositioneerd en nauwkeurig geroteerd om elke verlichtingspatroon te genereren.
Reconstructie van TIRF-SIM beelden vereist de aankoop van minimaal drie faseverschuivingen per omwenteling patroon daarom de SLM patroon periode moet deelbaar zijn door 3 (zie figuur 1). Bijvoorbeeld, een periode van 9 pixels voor 488 nm belichting en 12 pixels voor 640 nm belichting. Voor een uitgebreide bespreking van de SLM patroon ontwerp, met inbegrip van sub-pixel optimalisatie van de patroon spatiëring gebruiken geschoren roostersZie het eerdere werk van Kner et al. 16 en Lu-Walther et al. 20 De positie van de twee excitatie brandpunten moet in de TIR ring voor alle golflengten, maar de diffractiehoek van de ± 1 orden van de SLM golflengte afhankelijk. Voor standaard SIM kan veelkleurige beeldvormende worden bereikt door het optimaliseren van de rasterperiode van de langste golflengte en tolereren verlies in prestatie voor de korte kanalen. Voor TIRF-SIM echter geoptimaliseerd voor één golflengte betekent dat de andere golflengte brandpunten niet meer onder de TIR ring. Bijvoorbeeld met behulp van een rasterperiode van 9 pixels voldoende is om TIRF voor 488 nm, de foci bij 95% van de diameter van de rug opening binnen het TIR ring, maar 640 nm die periode zouden de brandpunten buitenpositie de opening. Daarom moet verschillen pixelpatroon tussenruimtes worden gebruikt voor elke excitatiegolflengte.
De uitlijning van de TIRF-SIM excitatie padextreem gevoelig is voor kleine veranderingen in de positie van de dichroïsche spiegel (DM4 in figuur 1) in de microscoop lichaam, veel meer dan bij conventionele SIM. Gebruik van een roterend filter kubus carrousel wordt niet aanbevolen, in plaats daarvan een enkel multi-band dichroïsche spiegel, die in een vaste positie specifiek voor de excitatie golflengten gebruikte gehouden en gemaakt. Het is essentieel dat alleen de hoogste kwaliteit dichroïsche spiegels worden gebruikt. Deze vereisen dikke substraten van tenminste 3 mm, en worden vaak aangeduid als "platte imaging" door de fabrikanten. Alle andere substraten leiden tot ondraaglijke aberratie en verslechtering van het beeld in TIRF-SIM.
polarisatie controle
Om TIRF-SIM bereiken moeten de polarisatietoestand van het excitatielicht roteert synchroon met het verlichtingspatroon zodat blijft azimutaal gepolariseerd in de doelstelling pupilvlak ten opzichte van de optische as (dwz. s-gepolariseerde). Aanpassing van de polarisatiecontrole optica zal afhangen van de specifieke optische element gebruikt, bijvoorbeeld een Pockels cel 21, of een halve golfplaat bij een motorisch draaibare fase 22. In dit protocol een custom vloeibaar kristal variabele retarder (LCVR) wordt gebruikt, die full-wave (2π) retardance verschaffen via golflengtegebied 488-640 nm omdat hiermee snel (~ msec) schakelen. Bij gebruik van een vloeibaar kristal retarder is het essentieel om een hoge kwaliteit component: standaardcomponenten zijn meestal niet stabiel genoeg om een constante retardance geven over de lengte van de belichting tijd, die leidt tot dispersie van het verlichtingspatroon en lage modulatie contrast . Vloeibare kristallen vertragers zijn ook sterk afhankelijk van de temperatuur en vereisen ingebouwde temperatuurregeling.
Synchronisatie
De lasers worden gesynchroniseerd met de SLM. Binaire ferroelektrische SLM intern evenwicht door sbeheksen tussen een op de staatstelevisie en uit staat. De pixels alleen optreden als halve golf platen in zowel hun aan of uit staat, maar niet tijdens de interframe schakeltijd. Daarom de lasers moet alleen worden ingeschakeld in het aan / uit-toestand via de LED activeringssignaal van de SLM een vermindering van patroon tegenstelling voorkomen door het tussenstadium van de pixels. Een akoesto-optische modulator (AOM) kan ook worden gebruikt als een snelle sluiter als de lasers niet digitaal worden gemoduleerd.
Keuze van lenzen
Op basis van deze beperkingen, de gewenste verkleining van de SLM vlak op het monstervlak om het gewenste verlichtingspatronen kan worden bepaald. Dit maakt de berekening van de focale lengten van de twee lenzen L3 en L4 in het beeld relais telescoop en de excitatie condensorlens L5. In dit systeem wordt een 100X / 1.49NA olie-immersie objectieflens wordt gebruikt bij 488 nm en 640 nm excitatie en gebruikt dus brandpuntsafstand van 300 en 140 mmvoor L4 en L3 en 300 mm voor L5, wat een totaal verkleining van 357x, wat overeenkomt met een SLM pixelgrootte van 38 nm op het monstervlak. Met deze combinatie van lenzen, SLM rasterperiodes van 9 voor 488 nm belichting en 12 pixels voor 640 nm patroon tussenruimte van 172 en 229 nm te geven aan het monster, overeenkomend met invalshoeken van 70 ° en 67 ° respectievelijk. Een glas-water grensvlak, de kritische hoek is 61 °, en is onafhankelijk van de golflengte, dus beide patroon afstanden mogelijk TIRF excitatie voor beide golflengten. Een objectieflens voorzien van een correctie kraag is nuttig voor correctie van sferische aberraties geïntroduceerd door variaties in dikte dekglaasje, of indien deze werkt bij 37 ° C.
Beeldreconstructie
Zodra ruwe simgegevens is verkregen is een kwestie van rekentijd voor super opgeloste beelden in een tweestapsproces genereren. Enerzijds het verlichtingspatroon te worden bepaaldelke afbeelding en ten tweede moet de componenten van de SIM spectrum worden gescheiden en op geschikte wijze gecombineerd dat een daadwerkelijk OTF drager (zie figuur 6, bijvoegsels) verdubbelen.
Precieze kennis van de geprojecteerde verlichtingspatronen het grootste belang, aangezien de super opgelost frequentiecomponenten hebben ongemengde zo nauwkeurig mogelijk artefacten veroorzaakt door de resterende delen van overlappende componenten te voorkomen. We bepalen de verlichtingspatroon parameters a posteriori uit de ruwe beeldgegevens volgens de procedure geïntroduceerd door Gustafsson et al. 23 Kortom, een set van verlichting parameters die een genormaliseerde tweedimensionale sinusoïde beschreven moet worden gevonden voor elk van de excitatiepatronen :
Hierbij es beschrijven de pony contrast en het patroon respectievelijk startfase van elke individuele afbeelding m. De componenten van de golfvector, es , Alleen veranderen met de verschillende oriëntaties van de patroon en kan overigens gelijkblijvende verondersteld te zijn. Om grof bepalen van de componenten van de golf vector een kruiscorrelatie ruwe beeld spectra wordt uitgevoerd, wordt geraffineerd door toepassing subpixel verschuift naar een van de kruis-gecorreleerde beelden om de overlap te optimaliseren. Dit gebeurt via vermenigvuldiging van real-space fase gradiënten dat leiden tot een subpixel verschuiving in frefrequentie-ruimte. Merk op dat het nuttig is om een goede schatting van de golf-vectoren voorafgaand af van de exacte schatting patroon en dit kan worden gevonden door het afbeelden van een fluorescerende laag bead.
Aangezien de fase stap tussen verschoven patronen is , Dwz. De scheiding van frequentiecomponenten kan worden uitgevoerd door een Fourier-transformatie langs de "fase-as". De wereldwijde fase en de pony contrast kan dan worden bepaald met behulp van complexe lineaire regressie van verschillende componenten. De afzonderlijke componenten gescheiden worden dan gecombineerd met een gegeneraliseerde Wiener filter. Voor een gedetailleerde beschrijving van zowel de parameter extractie en de uitvoering van de algemene Wiener filter verwijzen we de lezer naar Gustafssonet al. 23 waarbij hetzelfde algoritme wordt gebruikt.
Custom-built TIRF-SIM-systemen, zoals de setup die in dit protocol zijn in staat multicolor super-resolutie imaging met hoge snelheid in vergelijking met in de handel verkrijgbare microscopen. De inherente voordelen van SIM als een super-resolutie techniek is dat de temporele resolutie niet wordt beperkt door de fotofysica van de fluorofoor, vergeleken met andere methoden zoals moleculen lokalisatie microscopie (SMLM) of bijzondere scanmethodes zoals gestimuleerde emissie uitputting microscopie ( STED). In tegenstelling tot deze andere technieken, is SIM-kaart niet nodig photoswitchable of onuitputtelijk fluoroforen zo multicolor beeldvorming is eenvoudig. Niet TIRF-SIM systemen, zoals optische snijden SIM en multifocale SIM kan bereiken doorgaans resolutie verbeteringen van 1,7 keer of minder in een feitelijke de factor 2 verbeterd hier vermeld, en commerciële systemen zijn vaak langzamer en minder flexibel dan het systeem in dit protocol.
"> De twee belangrijkste problemen bij de uitvoering van deze techniek zijn enerzijds de noodzaak van nauwkeurige positionering van de zes SIM bundels in de TIR zone achterkant apertuur doel, dat een bewerkelijk en vergt tijd in beslag optische uitlijning procedure. Ten tweede, hoge patroon contrast produceren bij het monster, polarisatie draaiing van essentieel belang is. voor lage NA 2D-SIM-systemen, kan polarisatierotatie worden vermeden door zorgvuldige keuze van de lineaire polarisatie oriëntatie, maar wordt dit onmogelijk voor TIRF-SIM 25. voor high-speed multicolor beeldvorming, electro- optische polarisatieregeling noodzakelijk is en dit verhoogt de complexiteit en kosten van het systeem.Beperkingen van de techniek
TIRF-SIM, als conventionele TIRF, is natuurlijk beperkt tot waarneming van biologische structuren en processen bij het basale celmembraan die kunnen worden verlicht door het 150-200 nm penetratiediepte van het verdwijnende veld. TerwijlSIM wordt vaak aangehaald als minder photodamaging cellen dan zowel STED of SMLM gaat laterale resolutie verdubbeling toch het vereiste aantal fotonen met tenminste 4 maal 5 in vergelijking met conventionele TIRF microscopie. Voor de beeldvorming bij hoge frame rates met een korte blootstelling keer, deze foton toename vereist het gebruik van een verhoogde verlichting intensiteiten. Hoewel elke fluorofoor kan worden gebruikt voor SIM beeldvorming van bewegende monsters vast of langzaam, hoge helderheid fluorescente proteïnen of volgende generatie synthetische kleurstoffen met verbeterde fotostabiliteit worden aanbevolen voor live cell imaging.
Hoewel deze implementatie kan afbeelden van een enkele kleur op SIM framesnelheden dan 20 Hz is, wordt meerkleurige beeldvorming in de gepresenteerde systeem beperkt door de schakeltijd van de gemotoriseerde emissie filterwiel. Vanwege de grote omvang van de sCMOS camera chip, zou het gebruik van een multiband emissiefilter en het splitsen optica mogelijk zijn en mogelijk gelijktijdig imaging met meerdere golflengtes zonder snelheid boete. Een andere mogelijkheid is de verschillende excitatie lasers afwisselen en gebruik een multiband notch filter om het excitatielicht verwerpen. Het gebruik van een binaire ferroelektrische SLM in deze uitvoering is niet optimaal. De diffractie-efficiëntie van een dergelijke SLM is zeer laag, dus de meeste van het invallende licht is in de nulde orde reflectie die wordt weggefilterd door de ruimtelijke masker. Voor toepassingen die een zeer hoge frame rates, wordt de beeldvorming snelheid dus beperkt door het uitgangsvermogen van de laser diodes. De SLM wordt ook een aantal ellipticiteit in de polarisatie voor golflengten weg van de 550 nm golflengte ontwerp waarbij de pixels niet als ideale halve golf platen te bedienen. Hoewel dit naar zou worden gecompenseerd door een additionele LCVR, kan de ideale oplossing het gebruik van een digitale microspiegel inrichting (DMD) als patroongenerator zijn.
eventuele wijzigingen
De setup preseHier nted is flexibel en eenvoudig worden aangepast dan commerciële instrumenten zodat andere beeldvormingsmodaliteiten zoals 3D-SIM, snelle 2D-SIM, multifocale SIM (MSIM) en niet-lineaire SIM (NL-SIM) kan worden uitgevoerd 21,34,35.
2D-SIM kan goed geschikt voor het afbeelden van relatief vlak, snel bewegende structuren zoals perifere endoplasmatisch reticulum zijn. De perifere ER dieper ligt dan binnen de cel kan worden verlicht met een TIRF verdwijnende veld maar vanwege de vlakke structuur kan worden afgebeeld met behulp van standaard 2D-SIM met verwaarloosbare out-of-focus achtergrond. Bovendien kan het gebruik van verbeterde optische sectie reconstructiealgoritmes onderdrukken out-of-focus licht breiden het gebruik van 2D-SIM optisch dikke monsters, wanneer zij axiale resolutie verdubbeling is niet vereist 21.
In MSIM wordt het monster verlicht door een dun rooster excitatie foci 36. Deze modaliteit kan worden uitgevoerd door eenvoudige verwijdering van de ruimtelijke masker (SM) En vervangen door een polarisator. De SLM heeft nu als een amplitude modulator. De binaire SIM roosters op het SLM kan worden vervangen door een 2D rooster vlekken, de grootte van de gekozen gelijk aan de omvang van een diffractie beperkte focus in het beeldvlak te plaatsen. In figuur 7A wordt een rooster van 4 x 4 pixelvierkanten op het SLM (inzet) die, wanneer demagnified op het monster genereert diffractie beperkte foci van 150 x 150 nm, gezien de fysieke SLM pixelgrootte van 13,62 urn. De excitatie foci vervolgens kan worden door het verschuiven van de rooster patroon op de SLM en dit wordt meerdere malen herhaald om het gehele gezichtsveld te verlichten. Beelden werden per vertaalde patroonpositie en de stapel nabewerkt tot een gereconstrueerd beeld met een betere resolutie van maximaal wijken voor een factor en verminderde out-of-focus licht ten opzichte van het het equivalent groothoek tot30. Deze modaliteit kan nuttig zijn voor het afbeelden van dikke, dichte monsters waarvoor standaard SIM ongeschikt, bijvoorbeeld lage contrast structuren zoals gekleurd rode bloedcellen (figuur 7C), hoewel de acquisitietijd is toegenomen als gevolg van het grote aantal ruwe frames benodigde gezichtsveld (hier N = 168).
Tenslotte kan de opstelling worden aangepast om ofwel hoge NA lineaire TIRF-SIM of gepatroneerde activering niet-lineaire SIM (PA NL-SIM) inschakelen, zoals onlangs door Li et al., Door gebruik van een ultrahoge 1,7 NA doelstelling of aanvulling van een 405 nm laser fotoactivatie en zorgvuldige optimalisering van de SLM raster patronen 35.
toekomstige toepassingen
SIM is nog steeds een zich snel ontwikkelende techniek en vele toepassingen in de life sciences zullen worden ingeschakeld in de toekomst. De snelheid, resolutie en contrast verbeteringen van de techniek en de mogelijkheid om met behulp van standaard fluoroforen mean dat Bio-imaging, SIM ingesteld op conventionele vele microscoopsystemen, zoals confocale en breedveld platforms vervangen. Commerciële SIM-systemen zijn reeds beschikbaar vandaag de dag met een uitstekende technische specificaties, maar ze zijn buiten het financiële bereik van vele onderzoekslaboratoria, en, heel belangrijk, ze zijn niet flexibel worden aangepast en ontwikkeld om de meest recente ontwikkelingen in het onderzoek op het terrein uit te voeren. Ze missen ook de essentiële mogelijkheid om 'worden aangepast voor het experiment bij de hand', vaak een kritisch knelpunt in cutting edge life science onderzoek. Het hier beschreven systeem zal bijzonder geschikt zijn om dynamische processen te bestuderen nabij het celoppervlak, in vitro gereconstitueerde dubbellaag systemen voor oppervlaktechemie bestuderen in de materialen en natuurkunde, bijv. 2D materialen, en vele andere toepassingen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Leverhulme Trust, de Techniek en Physical Sciences Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] en Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Wij danken E. Avezov en M. Lu voor transfectie van de LifeAct-GFP en cytosolische GFP-cellen respectievelijk, en W. Chen voor de voorbereiding van de HEK293 cultuur. We danken ook K. O'Holleran voor hulp bij het ontwerp van de microscoop, en L. Shao en R. Heintzmann voor nuttige discussies en suggesties.
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400 – 800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |