We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
כאן אנו מתארים הליך מפורט ביעילות ישירות לספק אינפלואנזה המופילוס לתוך שטחי הנשימה התחתונות של עכברים. אנו מדגימים את הליך הכנת H. בידוד אינפלואנזה, החדרת תוך-קנה נשימה של H. אינפלואנזה לתוך הריאות, אוסף של נוזל שטיפת broncho-מכתשים (BALF), ניתוח של תאים חיסוניים BALF, ובידוד RNA עבור ניתוח ביטוי גני הפרש. הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את תגובת הריאות דלקתית לכל חיידקים, וירוסים או פטריות. החדרה קנה נשימה ישירה היא המועדפת בעיקר על נהלי משאיפת אפים או תרסיס כי זה יותר יעיל מספק את בידוד החיידקים לתוך דרך הנשימה התחתונה עם עמימות פחות.
דלקת היא מנגנון חיסון יסוד של הגנה מפני גורמים מזהמים. זה מקדם מיגור פתוגן ותיקון של רקמות אשר ניזוקו. זה גם מקל על שחזור למצב נורמלי בריא 1. עם זאת, דלקת dysregulated מובילה לעיתים קרובות מחלות דלקתיות כרוניות 2. דלקת דרכי הנשימה היא טריגר ראשוני למחלות ריאה שונים כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה פיברוזיס ריאתי 3.
אינפלואנזה המופילוס הלא typeable (unencapsulated) (NTHi) קשורה למחלות ריאה דלקתיות העליון כרונית והתחתון 4,5. זהו המין השולט שבודד את דרכי הנשימה התחתונה של ילדים ומבוגרים עם 4,6,7 מחלת ריאות חסימתית כרונית. התגובה הדלקתית לאחר ההדבקה NTHi מתאפיין הגברת הביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת (כגון TNF ו- IL-1β), וזה מתווכת בmitogen y פרוטאין קינאז מופעל (MAPK) גורם-κB גרעיני (NF-κB) באמצעות קולטנים דמוי האגרה (TLRs) 8.
מודלי Mouse הם כלים שימושיים מאוד לניתוח הפתולוגיה הבסיסית של מחלה דלקתית ריאות בגלל הזמינות של קווי גן מחסר שונים. כמה שיטות שימשו לחסן חיידקים חיים / נחלש ומוצרים חיידקים, כולל החדרה אפי ו 9,10 משאיפת תרסיס. הנה, אנחנו מדגימים החדרת תוך-קנה נשימה. למרות בשימוש לעתים רחוקות, גישה זו היא יותר יעילה מאוד לשחזור בגלל המשלוח הישיר של הבידוד אל דרך הנשימה התחתונה.
בזאת, אנו מתארים הליך ייחודי פולשנית לחסן הריאות של עכברים עם פתוגן ריאות חיידקית. אנו מראים כי הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את הפונקציה של גנים שונים באמצעות עכברים כי חסרים גנים של מסלולי איתות דלקתיים. הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את התגובות הדלקתיות לזיהומי ריאות…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
Iml syringe | BD | REF 309602 | |
Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
Agarose | peqlab | 35-1020 | |
5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
BSA | HyClone | SH30574.03 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
Formaldehyde | Polyscience | 4018 |