طريقة سريعة لمعالجة الدم إلى زيادة الغلة من مستويات البلازما الببتيد في الدم البشري
Summary
يمكن استخدام طريقة معالجة الدم السريعة في البشر وينتج مستويات الببتيد أعلى وكذلك يسمح للتقييم من النموذج الجزيئي الصحيح. ولذلك، فإن هذه الطريقة أن يكون أداة قيمة في مجال البحوث الببتيد.
Abstract
البحوث في مجال تنظيم تناول الطعام تكتسب أهمية. هذا غالبا ما تتضمن قياس الببتيدات التي تنظم تناول الطعام. لتحديد الصحيح من تركيز الببتيد، ويجب أن تكون مستقرة أثناء معالجة الدم. ولكن هذا ليس هو الحال لعدة الببتيدات التي تدهورت بسرعة عن طريق peptidases الذاتية. مؤخرا، قمنا بتطوير طريقة معالجة الدم توظيف R educed درجات الحرارة، وcidification، rotease P تثبيط، وأنا sotopic الضوابط الخارجية وD ilution (RAPID) لاستخدامها في الفئران. هنا، قمنا بإنشاء هذه التقنية لاستخدامها في البشر والتحقيق الانتعاش، شكل الجزيئي وتعميم تركيز الهرمونات التنظيمية تناول الطعام. تحسين طريقة سريعة بشكل ملحوظ في استرداد 125 السوماتوستاتين-28 (+ 39٪) المسمى أنا، مثل الجلوكاجون الببتيد-1 (+ 35٪)، جريلين أسيل والجلوكاجون (+ 32٪)، والانسولين وkisspeptin (+ 29٪ )، نستافين 1 (+ 28٪)، ليبتين(+ 21٪)، والببتيد YY 3-36 (+ 19٪) مقارنة مع المعالجة القياسية (الدم EDTA على الجليد، ف <0.001). أظهر عالية الأداء اللوني السائل شطف من جريلين أسيل الذاتية على الموقف المتوقع بعد معالجة سريعة، بينما بعد المعالجة القياسية وتدهور 62٪ من هرمون جريلين أسيل مما أدى إلى الذروة في وقت سابق من المحتمل تمثل desacyl جريلين. بعد المعالجة RAPID كانت نسبة هرمون جريلين أسيل / desacyl في الدم من الموضوعات الوزن الطبيعي 1: 3 مقارنة 1:23 بعد المعالجة القياسية (ع = 0.03). كما كانت مستويات kisspeptin الذاتية أعلى بعد RAPID مقارنة مع المعالجة القياسية (+ 99٪، ع = 0.02). ويمكن استخدام طريقة معالجة الدم السريعة في البشر، وينتج مستويات الببتيد أعلى ويسمح للتقييم من النموذج الجزيئي الصحيح.
Introduction
في ظل الانتشار المتزايد في جميع أنحاء العالم من السمنة 1،2، والبحث في مجال تنظيم تناول الطعام تكتسب أهمية. بينما حتى الآن الببتيد واحد فقط هو معروف أن ينتج محيطيا ويتصرف مركزيا لتحفيز الاستهلاك الغذائي، وهي جريلين 3، خلال العقود الماضية، تم التعرف على مجموعة واسعة من الببتيدات التي تقلل من تناول الطعام، على سبيل المثال. اللبتين، الببتيد YY (PYY) وأيضا الجلوكاجون مثل الببتيد-1 (GLP-1) والانسولين 4، لذلك، في الدراسات التحقيق في الآليات التنظيمية للمستويات الجوع والببتيد الشبع وغالبا ما يتم تقييمها وفي نفس الوقت، فمن المفترض أن الببتيد درس مستقر وتعافى في عوائد عالية خلال تشكيل البلازما. ومع ذلك، في كثير من الأحيان ليست هذه هي القضية بسبب انهيار الذاتية السريع كما هو موضح من قبل لمثل. جريلين الذي تتحلل من أسيل لdesacyl جريلين 5. ولذلك، فإننا وصفها مؤخرا طريقة سريعة لتصنيع الدمالغناء في الفئران توظيف R educed درجات الحرارة، وcidification، rotease P تثبيط، وأنا sotopic الضوابط الخارجية وD ilution 6. تحسين هذه الطريقة لاسترداد 11 من 12 الببتيدات اختبارها وسمح لتحديد الصحيح شكل الجزيئي المتداولة مقارنة معالجة الدم العادي (EDTA الدم على الجليد) 6. وقد استخدم هذا الأسلوب في عدة دراسات لاحقة 7-12 للكشف عن تعميم جريلين فضلا عن الافراج عن القشرية عامل 13. ولذلك، أثبتت طريقة مفيدة للبحث الببتيد في القوارض. ومع ذلك، منذ الدراسات القوارض ليست دائما للترجمة إلى أنواع أخرى، وينبغي وضع طريقة لاستخدامها في دم الإنسان كذلك.
وكان الهدف من هذه الدراسة لاختبار طريقة سريعة لمعالجة الدم لدى البشر مقارنة معالجة الدم العادي، EDTA الدم على الجليد، والتي يوصى على نطاق واسع في كثير من الأحيان 14 و شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في السريري وكذلك إعداد البحوث. اختبرنا استرداد مجموعة مختارة من 125 الببتيدات المسمى I-المشاركة في تنظيم تناول الطعام بما في ذلك الببتيدات الثابتة، وكذلك المرشحين الجدد اقترح مؤخرا للعب دور في تغذية تنظيم (تظهر على استهلاك المواد الغذائية في الجدول 1) المعالجة التالية مع كل الأساليب. وقد تم اختيار الهرمونات أيضا لتمثيل الببتيدات من مختلف طول وتهمة (الجدول 2). وعلاوة على ذلك، لهرمون جريلين نحن التحقيق في شكل الجزيئي (ق) وفقا للطريقة القياسية والسريعة. وأخيرا، قمنا بتقييم جريلين الذاتية (أسيل وجريلين desacyl) وكذلك مستويات kisspeptin، الببتيد كما اقترح مؤخرا أن تلعب دورا في تنظيم تناول الطعام 15،16 التالية معالجة سريعة أو معيار. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن التحقيق أيضا هذه المستويات الببتيد في عدد السكان من الموضوعات مع مجموعة واسعة من مؤشر كتلة الجسم (تتراوح 10،2-67،6 كجم / م 2) لدراسة possibالخلافات جنيه المتعلقة وزن الجسم تتغير بشكل مزمن.
التشخيص والتقييم، والخطة:
المشاركين في الدراسة
وجميع المشاركين في الدراسة المستشفى حديثا المرضى (كان إدراج خلال يومين من الدخول إلى المستشفى) من قسم الطب النفسي في شاريتيه-Universitätsmedizin برلين وأعطى موافقة خطية مستنيرة. لتجنب أي تأثير من الجنسين أدرجت فقط المريضات. وشارك ما مجموعه 42 مواضيع في هذه الدراسة وقسمت إلى ثلاث مجموعات: الوزن الطبيعي (مؤشر كتلة الجسم 18،5 حتي 25 كجم / م 2، ن = 12)، فقدان الشهية العصبي (مؤشر كتلة الجسم <17.5 كغ / م 2، ن = 15) والسمنة (مؤشر كتلة الجسم> 30 كجم / م 2، ن = 15). كانت أنورإكسيك والمرضى يعانون من السمنة المفرطةتشخيص وفقا للتصنيف الدولي للأمراض-10 والمستشفى لزيادة الوزن (فقدان الشهية العصبي) أو تخفيض الوزن (السمنة)، على التوالي. نقلوا الى المستشفى جميع المرضى الوزن الطبيعي حصرا بسبب الأعراض الجسدية من دون اضطرابات جسدية ذات الصلة. تم استبعاد المرضى الذين يعانون من أعراض الجسدية الجهاز الهضمي أو تاريخ من جراحة الجهاز الهضمي. كما شملت معايير الاستبعاد عصر <18 عاما، والحمل الحالي والأمراض الذهانية غير المعالجة. تم إجراء جمع الدم في يوم 2 أو 3 بعد دخول المستشفى قبل تلقي العلاج الغذائي لزيادة أو خفض وزن الجسم، على التوالي. تم تقييم المعلمات الجسم البشري في نفس اليوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
ذكرنا من قبل أن طريقة سريعة لمعالجة الدم تحسين الانتعاش ل11/12 الببتيدات مقارنة معالجة الدم العادي في الفئران 6. في هذه الدراسة أظهرنا أن هذه الطريقة هي مناسبة أيضا لاستخدامها في البشر. وبعد معالجة سريعة، وتحسين الانتعاش لمدة 9 من 9 125 الببتيدات المسمى I-اختبا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل STE مؤسسة الأبحاث الألمانية 1765 / 3-1 (ع) والوزارة الألمانية للتعليم والبحوث 03IPT614A (CG). نشكر راينهارد لوميل والبتراء BUSSE حصول على الدعم الفني الممتاز وكذلك كارين يوهانسون وكريستينا Hentzschel للمساعدة في تنظيم وتنفيذ القياسات البشرية
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
Referencias
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. . Principles of Biochemistry. , (1973).
