An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.
The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.
Voksne stamceller (SCS) er afgørende for at opretholde vævshomeostase ved at erstatte døende celler og reparere beskadigede væv ved skade. Disse SC'er er defineret ved deres evne til at undergå løbende selvfornyelse og til at differentiere til forskellige cellelinier 1-3. De bedst undersøgte systemer, som er afhængige af voksne SC'er for deres genopfyldning, omfatter det hæmatopoietiske system, tarmen og huden 1,2,4.
Under embryogenese, huden begynder som et enkelt lag af epidermisceller. Morfogenese af hårsækken (HF) starter, når mesenchymceller befolke huden og danner en underliggende kollagene dermis 5. Specialiseret mesenkymale celler, der senere udgør dermal papilla (DP), organisere direkte under epidermal lag og stimulerer epitelet at danne hår placodes der begynder at vokse nedad 6. Stærkt prolifererende matrix celler, der ligger i bunden af HF,kuvert disse mesenkymale celler og danne hårløget, mens det indre lag begynder at differentiere til koncentriske cylindre til dannelse håret (HS) og den omgivende indvendige rod kappe (IRS) 2,3.
I postnatal levetid huden epidermis består af tre rum: det interfollicular epidermis (IFE), talgkirtlen (SG) og HF. I modsætning til IFE og SG som er i en konstant tilstand af homeostase, HF er en dynamisk mini-organ, som undergår kontinuerlig cyklusser af vækst (anagen), destruktion (catagen) og resten (telogen) 4,7. Hårsækken stamceller (HFSCs) at brændstof denne evige cyklus, bor i en specialiseret niche inden HF kaldes bule 4. Under anagen de HFSCs forlade bule, efter aktivering signaler fra DP, begynde prolifererende og ned nedad dermed skabe en lang lineær spor af celler kendt som den ydre rod kappe (ORS) 8-10. De matrix-celler, deromgiver DP ved foden af HF, hurtigt cyklus og migrere opad undergår terminal differentiering og dermed skabe HS og IRS 10 (figur 1). Varigheden af anagen bestemmer længden af hår og er afhængig af den proliferative og differentiering kapacitet af matrix cellerne 6. Når HF træder ind catagen, at den pågældende transit-forstærke matrix celler i pæren ophører formere, undergår apoptose og relatere helt, mens du trækker DP opad, indtil den når den ikke-cykling del af HF 8,11. Under denne tilbagetrækning HF danner en midlertidig struktur kendt som epithelial streng, som er karakteristisk for catagen, og indeholder mange apoptotiske celler. Hos mus, catagen varer mellem 3-4 dage og er højt synkroniseret i første hår cyklus. Når HF når telogen alle HFSCs bliver hvilende. De forskellige faser af HF cyklus er også karakteriseret ved ændringer i farven på musens hud på grund af melanin produktion. Ændringerne hud fra sort under anagen til mørkegrå under catagen til pink under telogen 6,7,12,13.
Figur 1: hårfolliklen cyklus. HF er sammensat af en fast øvre del og en nedre konstant remodeling, cykling del, der gennemgår løbende cyklusser af hurtig vækst (anagen), ødelæggelse (catagen) og en relativ ubevægelighed fase eller hvile (telogen). Klik her for at se et større version af denne figur.
SCS opretholde HF blev oprindeligt identificeret ved hjælp chase eksperimenter med tritieret thymidin, der afslørede en befolkning på langsom cykling label fastholde celler (LRC), der var bosat i den permanente region af HF lige under SG 14. Fremskridt i HFSCkarakterisering afslørede et lille antal markører, som kan anvendes til at identificere og isolere specifikke SC'er fra HF niche 15. Måske er den bedste markør for berigelse af HFSCs er CD34, en celle overflade markør også identificeret som en hæmatopoietisk SC markør hos mennesker 16. Inden for denne CD34 + populationer to distinkte populationer også er blevet isoleret baseret på α6 integrin ekspression 2. En anden markør er keratin 15 (K15), som er overudtrykt i fremspringsregionen, co-lokaliseres med CD34-ekspression og en K15 promotor anvendes til målretning og isolering HFSCs i transgene dyr 15,17-19. I det sidste årti er også blevet rapporteret flere andre distinkte populationer af HFSCs og stamceller til at opholde sig HF 17,20-27.
En ekstra spændende element i HFSCs er deres bidrag til hud reparation. Under normale forhold HFSCs genopbygge HF og deltager ikke i IFE homeostase. However, som reaktion på sårdannelse, disse celler forlader deres SC niche og støtte i genbefolkning IFE 9. Vi har for nylig demonstreret, at mus deleteret for pro-apoptotiske Sept4 / ARTS gen display et øget antal CD34, K15 og Sox9 + HFSCs, som er udtryk for resistens over for apoptose. HFSCs blev isoleret fra Sept4 / ARTS – / – dorsale skind udnytte fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), og der var mere end en fordobling af antallet af CD34 + og K15 + HFSCs. Disse Sept4 / ARTS – / – HFSCs blev udvidet in vitro og ikke kun gav anledning til flere kolonier, men var også i stand til at modstå barskere vilkår i forhold til kontroller 28.
Som et resultat af at have et øget antal HFSCs, Sept4 / Kunst – / – mus helbredt betydeligt hurtigere som reaktion på huden excision skader. Påfaldende, Sept4 / ARTS – / – mus displayeda stort antal regenererede HF fra sårlejet, og betydeligt mindre ar. Desuden mus slettet for XIAP (X-linked inhibitor af apoptose), den biokemiske mål for ARTS, viste forringet heling 28.
Vores resultater og arbejde udført i andre laboratorier har vist, at HFSCs tjene som en ideel model til at studere biologi og funktion af voksne SCs. Her beskriver vi metoden til berigelse og isolering af HFSCs og epidermiskeratinocytter baseret på ekspressionen af fire markører: integrin α6; integrin β1; Sca-1 (en markør for epidermale keratinocytter) og CD34. Lignende isolering af K15 + HFSCs kan også udføres ved hjælp af K15-GFP reporter mus 19.
Protokollen beskrevet her er veletableret til isolering HFSCs fra den dorsale hud af voksne mus, men kan lige så anvendes til isolering af andre populationer i HF struktur, baseret på valget af markører 2,16,23,28,29. Denne fremgangsmåde er navnlig fordelagtig i forhold til andre metoder til celleisolering, såsom væv dissociation, ved, at en specifik celletype kan vælges og høstet fra en blanding af heterogene cellepopulationer. Endvidere beskrives her fremgangsmåde er hurtig og pålidelig og kan anv…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.
Isoflurane | Primal Critical Care | 66794-017-10 | |
Carbon dioxide | – | – | |
Electro Shaver | Oster | Golden A5 | Shaver from any other company could be used |
70% ethanol | Gadot Lab | 830000051 | 96% ehtanol diluted with distilled water |
Dissection mat | Dissection tools from any provider can be used | ||
Forceps | Dumont | 11251-10 | Foreceps from any other company could be used |
Scissors | Dumont | 14094-11 | Scissors from any other company could be used |
Needles/Pins | – | – | |
Scalpel | Albion | 10 | Ensure that the scalpel has a blunt end |
Tissue culture dish 60mm x 15mm | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
PBS | – | In-house PBS without Calcium and Magnesium | |
0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-050-1A | Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly |
Pipettes 10ml | Sigma-Aldrich | Corning, 4488 | |
Ice | – | – | |
50 ml sterie centrifuge tubes | Minplast Ein-shemer | 35050-43 | |
70µM Cell strainer | Fisher | 22362548 | |
40µM Cell strainer | Fisher | 22362549 | |
Staining buffer | – | ||
Centrifuge | Eppendorf 5804 R | 5805 000.017 | |
FACS tubes with Cell strainer caps | Falcon | 352235 | |
FACS tubes | Falcon | 352063 | |
Integrin β1 | eBioscience | 25-0291 | 1:400 |
Integrin α6 | eBioscience | 15-0495 | 1:600 |
Sca I | eBioscience | 11-5981 | 1:200 |
CD34 | eBioscience | 9011-0349 | 1:300 |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 50ng/ml |
Dry Chelex | BioRad | 142-2842 | |
Beaker | Pyrex | – | |
Distilled H2O | – | – | |
Stir bar | – | – | |
NHCl | BioLab | 1903059 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Beit Haemek Biological Industries | 400718 | FBS obtained from a different company can be used |
1L glass bottle | Ilmabor | Boro 3.3 | |
Bottle top filter | Autofil | 1102-RLS |