Isolere hårsekken stamceller og epidermal Keratinocytter fra Dorsal Mouse Skin

Voksne stamceller (SCS) er avgjørende for å opprettholde vev homeostase ved å erstatte døende celler og reparere skadet vev ved skade. Disse SC'er er definert ved deres evne til å gjennomgå kontinuerlig selvfornyelse og for å differensiere til forskjellige celle linjene ^1-3. De beste studert systemer, som er avhengig av voksne SC'er for deres fylling, omfatter hematopoetiske system, tarmen og huden ^1,2,4.

I løpet av embryogenesen, begynner huden som et enkelt lag av epidermale celler. Morphogenesis av hårsekken (HF) starter når mesenchymalceller fylle huden og danner en underliggende kollagen dermis ^5. Spesialisert mesenchymale celler, som senere utgjør dermal papilla (DP), organisere rett under epidermal laget og stimulerer Epitel å danne hår placodes som begynner å vokse nedover ^6. Sterkt prolifererende matriseceller, som ligger ved bunnen av HF,konvolutt disse mesenchymale celler og danner hår pære, mens det indre lag begynner å differensiere til konsentriske sylindre for dannelse av håret (HS) og den omgivende indre rot skjede (IRS) ^2,3.

I postnatal livet huden epidermis består av tre avdelinger: den interfollicular epidermis (IFE), talgkjertel (SG) og HF. I motsetning til IFE og SG som er i en konstant tilstand av homeostase, er HF et dynamisk mini-organ som gjennomgår kontinuerlige sykluser av vekst (anagen), ødeleggelse (catagen) og resten (telogen) ^4,7. De hårsekken stamceller (HFSCs) som drivstoff denne evigvarende syklus, bor i en nisje innenfor HF kjent som bule ^4. Under anagen de HFSCs avslutte bule, etter aktiveringssignaler fra DP, begynner voksende og gå nedover og dermed skape en lang lineær sti av celler som kalles den ytre rot skjede (ORS) ^8-10. Matriseceller somomgir DP på bunnen av HF, hurtig syklus og migrere oppover gjennomgår terminal differensiering og dermed generere HS og IRS ¹⁰ (figur 1). Varigheten av anagen bestemmer lengden av håret og er avhengig av den proliferative kapasitet og differensiering av matrisecellene ^6. Når HF går inn katagene, til transitt-amplifisering av matrisecellene i pæren opphøre spre seg, gjennomgår apoptose og regress helt mens man trekker i DP oppover til den når den ikke-sykling del av den HF ^8,11. Under denne tilbaketrekning av HF danner en midlertidig struktur kjent som den epiteliale tråd, noe som er karakteristisk for Katagen, og inneholder mange apoptotiske celler. Hos mus, varer Katagen mellom 3-4 dager, og er sterkt synkronisert i den første håret syklus. Når HF når telogen alle HFSCs bli stillestående. De forskjellige stadier av HF-syklusen er også karakterisert ved endringer i fargen av musens hud på grunn av melanin produksjon. Huden forandrer seg fra svart under anagen til mørk grå under Katagen til rosa under telogen ^6,7,12,13.

Figur 1: hårsekken Cycle. HF består av en fast øvre del og en nedre stadig ombygging, sykling del som gjennomgår kontinuerlige sykluser med rask vekst (anagen), ødeleggelse (Katagen) og en relativ quiescence fase eller hvile (telogen). Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.

SCS opprettholde HF ble først identifisert ved hjelp jage eksperimenter, med tritium tymidin, som avslørte en befolkning på langsom sykling label feste celler (LRC) som bodde i den permanente sone av HF like under SG ^14. Fremskritt i HFSCkarakterisering viste et lite antall markører som kan brukes til å identifisere og isolere bestemte SC'er fra den HF nisje ^15. Kanskje den beste markør for anriking av HFSCs er CD34, en celleoverflaten markør også identifisert som en blodkreft SC markør hos mennesker ^16. Innenfor denne CD34 ⁺ populasjoner to atskilte populasjoner har også blitt isolert basert på α6 inte uttrykk ^to. En annen markør er keratin 15 (K15) som er sterkt uttrykt i bule region, co-lokaliserer med CD34 uttrykk og en K15 promoter brukes til å målrette og isolere HFSCs i transgene dyr ^15,17-19. I det siste tiåret flere andre distinkte populasjoner av HFSCs og stamceller har også blitt rapportert å ligge innenfor HF ^17,20-27.

En ekstra spennende funksjon i HFSCs er deres bidrag til huden reparasjon. Under normale forhold HFSCs fylle HF og ikke ta del i IFE homeostase. However, som svar på såret, disse cellene avslutte sin SC nisje og bistand i repopulating IFE ^9. Vi har nylig vist at mus slettet for den pro-apoptotiske Sept4 / ARTS genet skjerm et økt antall CD34, K15 og Sox9 ⁺ HFSCs, som viser en motstand mot apoptose. HFSCs ble isolert fra Sept4 / ARTS ^{– / –} rygg skins utnytte fluorescens aktivert celle sortering (FACS), og det var mer enn en dobling i antall CD34 ⁺ og K15 ⁺ HFSCs. Disse Sept4 / ARTS ^{– / –} HFSCs ble utvidet in vitro, og ikke bare ga opphav til flere kolonier, men var også i stand til å tåle strengere vilkår sammenlignet med kontroller ^28.

Som et resultat av å ha et økt antall HFSCs, Sept4 / kunst ^{– / –} mus helbredet betydelig raskere reaksjon på huden eksisjons- skader. Påfallende, Sept4 / ARTS ^{– / –} mus displayeda stort antall regenerert HFS fra såret, og betydelig mindre arr. Videre mus slettet for XIAP (X-bundet hemmer apoptose), den biokjemiske målet for ARTS, viste svekket sårheling ^28.

Våre resultater og arbeid som er utført i andre laboratorier har vist at HFSCs tjene som en ideell modell for å studere biologi og funksjon av voksne SC'er. Her beskriver vi metodikken for anrikning og isolering av HFSCs og epidermale keratinocytter basert på uttrykket av fire markører: inte α6; integrin β1; SCA-1 (en markør for epidermale keratinocytter) og CD34. Ligner isolering av K15 ⁺ HFSCs kan også utføres ved hjelp av K15-GFP reporter mus ^19.