Inriktnings Biofilm Associated<em> Staphylococcus aureus</em> Använda Resazurin baserade läkemedlet-känslighet analys
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
Patogena mikrober kan bilda biofilmer in vivo leder till icke-akuta kroniska infektioner 1. Biofilm relaterade infektioner är en allvarlig riskfaktor för medicinska procedurer som involverar implantation av främmande föremål (t.ex. konstgjorda ersättare ben, bröstimplantat) eller installation av luftstrupen rör eller urinkatetrar 2. I dessa sammanhang är behandlingen mot infektionen nästan alltid nödvändigt som biofilm baserade infektioner sällan rensas på egen hand, även i immunkompetenta individer. Staphylococcus aureus är en av de vanligaste observerade patogener inblandade i biofilm relaterade komplikationer som uppstår vid användning av invasiva medicintekniska produkter 3.
Tyvärr gör dem mer motståndskraftiga mot behandling än planktonceller 1,4 själva karaktären av biofilmer som en skyddande barriär, och utvärdering av förutspått klinisk effekt är en viktig del av både inledandeläkemedelsutveckling samt läkemedelsresistens övervakning. Det finns en ökande kvitto på att laboratorieförhållanden, med fokus på plankton kulturer, inte troget representera verkliga sjukdom 5. Ytterligare förvärrar problemet, är replikering av biofilm fenotyper svårt, och befintliga biofilm modeller är tråkiga och lider av högt inter- och intra-assay variation sex. Således, många forskare, genom nödvändighet, som standard planktoncellanalyser av drogkänslighet och därmed potentiellt försumma en viktig aspekt av bakteriell virulens och sjukdom.
Här beskriver vi protokoll för analys av bakterier, särskilt S. aureus, i förut odlade biofilmer som utnyttjar en 96-brunnars baserade biofilm systemet 7,8. Medan protokollet för biofilm formation och utmaning följer i huvudsak tillverkarens rekommendationer, presenterar vi en alternativ informationsrika metod för kvantifiering av livskraft biofilm efter utmaning. Kortfattat, bakterier odlas i tappen plattan, där biofilmer bildas på de utskjutande tapparna är anslutna till plattans lock. Efter biofilm formation, är pinnar försiktigt doppade i brunnarna i en färsk platta fylld med PBS för att avlägsna planktonceller. Den peg-lock, med biofilmer bifogade, överförs till en ny utmaning platta, innehållande olika koncentrationer av antibiotika som skall analyseras. Efter en andra inkubation lock igen avlägsnades, tvättades och överfördes till en återhämtnings platta innehållande resazurin färgämne, där de genomgår en slutlig inkubation. Resazurin konvertering kan registreras kinetiskt eller tas som en slutpunkt läsning efter en viss återhämtningsperiod. Detta färgämne-baserad metod för att kvantifiera livskraften i biofilmer skiljer sig väsentligt från de tråkiga CFU (kolonibildande enheter) räknas baserad metod som beskrivs i det ursprungliga protokollet 7. OD 600 mätningar av läkemedlet utmaningen plattan och resazurin konverterings kinetik fungera som lönsamheten lästaouts av plankton och biofilm celler, respektive, som erbjuder en snabb, pålitlig, informationsrika och tekniskt enkel analys för biofilm överlevnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi beskrivit en modifierad biofilm analys för att bestämma aktiviteten hos testade inhibitorer på S. aureus biofilmer med fokus på metabola tillstånd av biofilm associerade celler. Medan den beskrivna biofilm initiering och överprövningsförfaranden mestadels härmade tillverkarens rekommendationer, användning av resazurin färgämnet att detektera och kvantifiera biofilmassocierade celler som överlever en inhibitor utmaning 24 timmar förenklar dramatiskt det rekommenderade förfarandet för …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
Referencias
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development – can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror ‘real-world’ pathogenesis?. Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
