دراسة إشارات Wnt خلال الزخرفة من إجراء الخطوط الجوية
Summary
استخدام الفئران مراسل بالإضافة إلى جبل بأكمله وقسم التلوين، والفحص المجهري وفي المقايسات فيفو يسهل تحليل الآليات الكامنة والزخرفة طبيعية من الجهاز التنفسي. نحن هنا تصف كيف ساهمت هذه التقنيات لتحليل إشارات Wnt خلال تطوير القصبة الهوائية.
Abstract
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Introduction
يبدأ تطوير الجهاز التنفسي بعد يوم الجنينية 9 (E9) مع ظهور خلايا إيجابية Nkx2.1 في الأديم الباطن بطني المعى الأمامي 1،2. وفصل أنبوب المريء القصبة الهوائية حل من قبل E11.5 عندما الأنابيب يمكن تمييزها باعتبارها كيانات متميزة، كل تحيط بها الأنسجة الوسيطة 3. يشير WNT تلعب دورا رئيسيا في مواصفات الجهاز التنفسي كما حذف Wnt2 وWnt2b، التي أعرب عنها اللحمة المتوسطة حشوي وحذف β-كاتينين من ظهارة تنفسية الأديم الباطن سوف يؤدي إلى عدم تخلق الرئة 4،5. قررت دراساتنا السابقة أن حذف ولس، مستقبلات البضائع التوسط إفراز كل بروابط WNT، من الأديم الباطن النتائج الجهاز التنفسي في نقص تنسج الرئة، وعيوب في تطوير الأوعية الدموية الرئوية وسوء الزخرفة من اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية 6،7. وتدعم هذه البيانات أهمية كرو-الظهارية الوسيطةSS الحديث في تمايز الخلايا والمواصفات، وكما ثبت في دراسات أخرى 8،9.
تعتمد دراسة المراحل الأولى من نمو الرئة لدى الوراثية، في المختبر، وبحكم التقنيات الحية التي سمحت لنا أن نفهم آليات القيادة هوية الجهاز التنفسي 10-16 أفضل. وقد استخدمت على نطاق واسع كلها الثقافات يزدرع الرئة في الطور البيني سائل الهواء لدراسة تأثيرات عوامل النمو في المراحل المبكرة من الرئة المتفرعة التشكل 10،17،18. في حين يتم استخدام هذا الأسلوب كما قراءات من تغيرات شكلية، مثل المتفرعة التشكل، وتعديل التعبير الجيني، فإنه يقتصر على دراسة المراحل الأولى من العملية التنموية، حيث أن الثقافة نفسها لا يدعم تطوير الأوعية الدموية 17. تطوير غضروف القصبة الهوائية تتطلب مرات حضانة أطول قد تكون غير متوافقة مع هذه التقنية الثقافة.
ليحلله دور إشارات Wnt خلال تشكيل الجهاز التنفسي، وتكيفنا التقنيات القياسية لتلبية احتياجات الدراسات الجنينية لدينا. لقد قمنا بتعديل مجلدات، وأحيانا تلطيخ، وتجهيز الدراجات لتضمين البارافين وتوقيت لتطهير للنسيج القصبة الهوائية والرئة. وكان الهدف الرئيسي من تحقيق الاستفادة المثلى من التقنيات الموضحة في هذه الدراسة إلى تحليل المراحل الأولى من تطوير القصبة الهوائية في الفئران التي تجري من E11 إلى E14.5. باستخدام الفئران مراسل خط Axin2LacZ نحن المواقع المحددة بدقة من WNT النشاط / β-كاتينين في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية النامية. تكيفنا أيضا إجراء تلطيخ كتين لكامل جبل أنسجة القصبة الهوائية. وهكذا، كنا قادرين على تصور تكثفات الوسيطة والتنبؤ المواقع التي تكون الغضروف سوف تأخذ مكان. تلطيخ جبل كله وأجزاء من الأنسجة الجنينية تم الحصول عليها من الفئران WlsShhCre، إلى جانب تقنيات المجهر المتقدمة، سمح لنا لكشف النقاب عن دور بروابط WNT التي تنتجها هيئة تنظيم الاتصالاتظهارة cheal في الزخرفة القصبة الهوائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأحداث الكامنة وراء التشكل من الجهاز التنفسي ليست مفهومة تماما، وخاصة العمليات اللازمة لتنميط الشعب الهوائية إجراء. وقد استخدمت الدراسات السابقة المجراة سابقا تقنيات حيث إإكسبلنتس النامية مثقف في الطور البيني الهواء السائل أو جزءا لا يتجزأ من matrigel 21،22.…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف مساعدة مايك Muntifering ومات Kofron مع التصوير متحد البؤر وغيل ماكي مع إجراءات النسيجية. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة، NHLBI (K01HL115447 إلى DS).
Materials
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
Referencias
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
