Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
Nöropsikiyatrik bozukluğu olan hastalar genellikle sosyal iletişim açıkları görüntüler (örneğin, otizm spektrum bozuklukları, şizofreni, ya da Alzheimer hastalığı olan hastalar) 1. Genetiği fareler daha sık olan mühendislik bu hastalıkların 2 genetik nedenlerini modellemek için kullanılır. Bu fare modellerinde sosyal iletişim okuyan atipik sosyal işlev bozukluklarının yol açan genetik mutasyon mekanizmalarının anlaşılması ve yeni tedaviler test etmek için yüksek ilgi çekicidir. fareler sosyal hayvanlardır ve kokusal, dokunsal, görsel ve akustik sinyalleri kullanarak birbirleri ile iletişim kurduğundan, sosyal iletişimi değerlendirmek için uygun modellerdir.
Fare ultrasonik sesler çıkarma şimdi, şu anda en son çalışmalar Argu bile, vokal iletişim açıkları 3,4 (ama yine de 5,6 tartışılan bu türün vokal öğrenme varlığının genetik temellerini modellemek için bir vekil olarak kullanılırvokal öğrenme 7) yokluğunda e. Laboratuvar fareleri (referans gözden 8) eşcinsel sosyal etkileşimlerde, kadın-erkek sosyo-seksüel etkileşimlerde, anne-bebek ilişkileri ultrasonik seslenmelere yayan bulunmuştur ve çocuk-çocuk sosyal etkileşimler 9. Baraj ve littermates 10 izole fare yavrular yaşamın ilk iki haftasında izolasyon çağrıları yayarlar. Erkekler ne zaman 11,12 (onu veya idrar ipuçları) bir kızışma kadın varlığında ultrasonik seslenmelere yayarlar. Aynı cinsten 13,14 bilinmeyen bir conspecific ile etkileşim halindeyken erkek ve dişileri ultrasonik seslendirme yayarlar. organizasyon ve bu seslerin fonksiyonları tamamen açık değildir ve daha fazla araştırma gerekiyor. Fonksiyonel açıdan geçerli bilgi yavru izolasyon aramaları, yetişkin erkek vocalizat doğru yetişkin kadın yakınlığı kolaylaştırılması işitme annelerinde alma davranışı ortaya çıkarma ile sınırlıdıriyonları 15 ve yetişkin dişi seslenmelere 16 işitme yetişkin erkeklerin artan keşif davranışı.
nöropsikiyatrik bozuklukların fare modellerinde vokal iletişim anormallikleri karakterize deneysel koşullar önemli bir katkı ekarte etmek için standardize koşullarda yapılmalıdır. eşzamanlı sosyal etkileşimler ve çeşitli genetik modeller nörobiyolojik çalışmaların değerlendirilmesi ile birlikte bu tür nitelendirmeler, fare ultrasonik iletişimin farklı yönlerine genetik katkısı bilgimizi geliştirmek gerekir. Bir uzun vadede, insanlarda sosyal iletişimin bazı nörobiyolojik temeller üzerine daha fazla ışık vermelidir. Biz şu anda güvenilir gelişimi sırasında ve laboratuvarda hem erkek hem de dişi fareler için yetişkinlikte ultrasonik seslenmelere ortaya çıkarmak için basit protokolleri sağlamayı amaçlıyor. Bu tür protokoller daha güvenilir Ultr karşılaştırmak için kayıtların standardizasyon kolaylaştırmak gerekirsuşları ve laboratuarlar arasındaki Asonic seslendirme emisyonları. Ayrıca fare ultrasonik sesler çıkarma kayıtları ile önceden deneyime sahip laboratuvarlarda tür kayıtların kurulmasını kolaylaştıracaktır. Biz de sosyal bozukluklar yanı sıra ultrasonik seslerin emisyon bağlamına önemli bilgileri elde etmek için, erişkin farelerde sosyal etkileşimler sırasında eş zamanlı olarak toplanan detaylı davranışsal verilerle ultrasonik sesler çıkarma verileri birleştirmek için geçerli olasılığını vurgulayın. Bu tür analizler organizasyon ve fare ultrasonik seslerin fonksiyonları üzerinde yeni bir ışık tutacaktır. Son olarak, biz de mouseTube veritabanı (http://mousetube.pasteur.fr) üzerinde tüm bilim camiası ile ultrasonik seslendirme kayıtları paylaşmak imkanı duyururlar. ses kayıt verilerine açık erişim bilim adamları, diğer labo kaydedilen ultrasonik sesler çıkarma ile kendi verilerini karşılaştırmak için izin vererek fare ultrasonik iletişim bilgilerini artırmak gerekir(Benzer veya farklı suşlar / protokolleri ile) ratories ve / veya farklı koşullar altında kaydedilen dosyaları ile analiz yöntemlerinin meydan.
Burada sunulan protokol laboratuvarda fare ultrasonik seslenmelere toplamak için standardize ve güvenilir yollar sağlar. Bunlar çok kısıtlı durumlar standardizasyon avantajı sunuyoruz. Bu suşlar 18,19,26,27 olan ırkları veya genotipleri karşılaştırma başarı ile kullanılmaktadır. Örnek sonuçlar de görüldüğü gibi, bu yöntemler, Shank2, otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı bir genin mutasyona uğramış farelerde atipik sosyal iletişim tanımlanmasına izin verir. Laboratuarlar farklı bağlamlarda arasında, hatta aralarında fare suşları arasındaki karşılaştırmalar, mouseTube veritabanı üzerinde büyük veri kümelerinin kullanılabilirliği ile tetiklenir. Bu araç çok değişkenli analizler izin vererek fare ultrasonik sesler çıkarma çalışmaları artırmak gerekir.
genetik c modelleme çalışmaların çoğunda yapıldığı gibi burada açıklanan protokoller, bir suş içinde farklı genotipleri fareler test etmek için optimize edilmiştirnöropsikiyatrik bozukluklar ontribution. Deneysel olarak mümkün olan en iyi kontrol bilgisi için her bir çalışma tasarımı önerilmektedir. Nitekim, çöp etkileri maskelemek veya yapay genetik etkiler 28,29 şişirmek olabilir. Her genotip için yavru kontroller için tavsiye edilir. Bir çöp içinde mutant ve kontrol fareleri doğru eşleme sağlayacak beri Islahı heterozigot anne nedenle tercih edilmelidir. Bu iki günde kayıtları boyunca bireyleri izlemek için (genotip kör) tüm yavruların işaretleme pençe dövme haklı. Genotiplendirme kuyruk numune alarak, sütten yapılır. P2 yavru izolasyon çağrıları üzerine kayıt yaparken, biz bu operasyon ek manipülasyon ve bir kayıt oturumu zaman çok yakın stres içerdiğinden, yavrular zaten kuyruk örnekleri alarak tavsiye etmem.
Burada önerilen protokoller emi açık kimlik izin vermez yetişkinlerde ultrasonik seslenmelere ortaya çıkarmak içinseslerin tter. Biz test hayvanının motivasyonunu manipüle açıklıyor. Nitekim, deney fareleri izole edilir ve yeni köşe ve deney hayvanları eşcinsel etkileşimler sırasında deney kafesine uzun süre alışabilir. kadın-erkek etkileşimleri tanıtıldı kadın izole değildir ve test erkek motivasyon bu cinsel bağlamda yüksek olabilir çünkü kısa süre alıştırır. motivasyon bu manipülasyonlar seslenmelere ve tanıtılan bir yayan Test fare olasılığını maksimize edilmelidir. Cinsel bağlamda erkek ultrasonik seslenmelere kaydetmek için, bir kızgınlık kadın taze (yani, dondurulmuş değil) idrar ile basit pamuklu çubukla da kafeste 30 sokulabilir. Bu yöntem% 100 kesin test erkek ultrasonik seslerin atanmasına olanak verir ancak bu seslerin emisyon gerçek toplumsal bağlam hakkında herhangi bir özel bilgi toplama önler. Bu nedenle, tercih Protocol (serbestçe hareket eden kızışma kadın ile) burada açıklanan. Biz de bir mutant suşu fareleri test ederken her zaman aynı soydan tanıtıldı fareler kullanmak ve vokal farelerin bir çift olarak verileri analiz etmek önerilir. Bir son çalışmada yayıcı 31 lokalize nirengi kullanımını teşvik etmektedir. Bu çalışmada, dişiler de bir erkek ile karşılaştığında sırasında ultrasonik seslenmelere yayarlar bulundu. Bu da kayıt seansından önce en az iki hafta içinde izole edilmiştir gerçeği ile açıklanabilir. video kayıtları düzgün senkronize edilir, bu çalışmada önerilen nirengi kullanımının genelleştirilmesi yine çoğu durumda seslerin yayıcı belirlenmesini izin vermelidir.
gelişimi sırasında kaydedilen yavrular izolasyon aramalar yatak arka plan gürültü ile rahatsız değil. Genellikle otomatik analiz ana değişkenleri ayıklamak için çok iyi çalışıyor. Buna karşılık, yetişkinlerin kaydedilen seslerin d vardıryatak hareket hayvanlardan arka plan gürültü isturbed. Otomatik analiz başarısız olabilir, ve bu nedenle de manuel analizi kullanılmalıdır. Bununla birlikte, deney kafesine yatak ekleme (fareler sevmiyorum) çıplak toprak daha hayvanlar için daha az stresli olan koşulları sağlamak gerekir. Toplumda daha fazla çaba, çeşitli koşullar altında bile bu ima arka plan gürültülerini ultrasonik seslerin otomatik algılama geliştirmeye yoğunlaşmıştır. Örneğin, ses yazılımı manuel arka plan gürültüsü 32 yokluğu nedeniyle seçilmiştir olan seslenmelere analiz etmeyi sağlar. Bu yazılım, akustik değişkenlerin çıkarma otomatik ama ilk manuel seçim ihtiyacı vardır.
Bireyler arası değişkenliği farelerin ses davranışı çok önemli olduğu unutulmamalıdır. Örneğin, bir kızgınlık kadın varlığında yetişkin erkeklerin çağrı oranı çok (Şekil 1) dağıtılır. Biz suDeneysel bağlamda ilgili değişkenliği sınırlamak için zaten ultrasonik seslenmelere ortaya çıkarmak için bu standart protokolleri ggest. Yine de, biz en önemlisi küçük boyutu 33 örneklerinde bireysel noktaları veri ortalama ve SEM sadece sunulmasının önemini işaret etmek istiyorum, ama istiyorum. temsili veri toplamak için her grup / genotip en az 12 bireyleri kayıt – eğer gerekli değildir – o da çok uygundur. Birçok durumda, bireyler arası değişkenlik (genellikle olamaz) gizli olmamalı ve bu bireyleri çalışılan genetik mutasyonu taşıyan ancak herhangi bir atipik fenotip görüntülenmiyor tanımlamak için yüksek öneme sahip olabilir. Bu tür bireyler, genetik bozuklukların tedavileri için yeni yollar açabilir tazminatlar, ilgili ipuçları sağlayabilir.
nöropsikiyatrik bozukluklar, vokal davranış ve sosyal kişiler için fare modellerinin en davranışsal karakterizasyonları düşünün vardıred dışında (örneğin, 19,27,34,35). Son analiz yöntemleri artık (örneğin MiceProfiler kullanarak) bir etkileşimin 36, yanı sıra ses kayıtları verilerle bu analizi birleştirmek imkanı sırasında sosyal etkinlikler ve olaylar dizilerin yarı otomatik detaylı karakterizasyonu sağlar. Bu yöntemin en önemli avantajı daha doğrusu toplumsal iletişimin yönlerinin etkilenen olduğunu belirlemek için, ASD fare modellerinde sosyal iletişimin kapsamlı bir görünümünü sağlamaktır. Mevcut protokol senkronizasyon hala manuel ama bu ses kayıt yazılımı aracılığıyla video kayıt tetikleyerek geliştirilebilir. analizler Bu tip nöropsikiyatrik bozuklukların fare modellerinde sosyal iletişim açıklarının daha kapsamlı bir görünüm sağlamak için standart haline gelmelidir. Buna ek olarak, şu ana kadar, vokal sinyaller çoğunlukla yayıcı tarafından analiz edilir (yani, testler vo emisyonunu lehine inşa edilirTest fare tarafından cal sinyaller, mevcut protokollerde olduğu gibi). Odak şimdi de daha iyi bu akustik sinyaller fonksiyonlarını belirlemek için, bu sinyallerin alıcı üzerinde ayarlanması gerekir. Bu, ya da yeni protokoller kurarak oynatma deneyleri 16 kullanılarak, aynı zamanda (örneğin MiceProfiler kullanarak) erişkinlerde mevcut protokollerde yeni köşe farelerin davranışlarını 36 değerlendirilerek yapılmalıdır. Nitekim, mevcut protokoller farelerde seslendirme emisyon tam etolojik koşullarını yansıtmak olmayabilir çok kısıtlı durumlar sağlar. ultrasonik seslerin spontan emisyon farelerin spontan vokal davranışı üzerinde daha fazla ışık tutacak sürekli ses ve video kayıtları kullanılarak daha iyi karakterize edilmesi gerekecektir.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |