Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
Um romance técnica de dissecção ea gravação é descrita para o acendimento monitoramento aferentes evocada pelo deslocamento mecânico de cadeiras no pavilhão auricular mouse. A técnica é muito custo-efetivo e facilmente realizado com materiais normalmente encontrados na maioria dos laboratórios de eletrofisiologia, ou facilmente adquiridos. A dissecção é simples e rápido, com o deslocamento mecânico fornecido por um wafer eletrocerâmicos genérico controlado por software proprietário. O mesmo software também registra e analisa a saída electroneurogram. A gravação da atividade do nervo evocado é através de um amplificador diferencial comercial ligado à microeletrodos de vidro padrão polido-fogo. dicas úteis são dadas para a melhoria da qualidade da preparação, o estímulo e as condições de gravação para otimizar a qualidade de gravação. O sistema é apropriado para ensaiar as propriedades electrofisiológicas e ópticas dos terminais lanceoladas terminações de paliçada de folículos de cabelo, bem como aos resultados a partir da sua manipulação farmacológica e / ou genética. Um exemplo da combinação de gravação eléctrico com a estimulação mecânica e etiquetagem com um corante vital estiril piridínio é dada.
Introduction
Os terminais lanceoladas de axônios sensitivos que inervam folículos pilosos em mamíferos formam paliçadas em todo o epitélio de cabelo eixo. Sua finalidade é detectar deslocamento mecânico dos pêlos que cercam. Eles são uma mistura de rápida e lenta adaptação terminações que produzem predominantemente rajadas curtas de atividade em resposta ao movimento do cabelo. Actividade deixa muito rapidamente quando o movimento pára, mesmo na presença de deslocamento continuado. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento deste modelo de orelha de murino para estudos correlativos da estrutura e função em terminais lanceoladas. O pavilhão tem muitas características vantajosas para estudar essas terminações. Em primeiro lugar, o pavilhão auricular é essencialmente duas camadas de pele transformada num back-to-back, com pouca outro tecido entre a interferir com o acesso para os folículos e terminais. A pele é muito fina e facilmente dissecados devido a quantidades mínimas de tecido conjuntivo resistente. A inervação é facilmente acessível e identificável. Enquanto follicl cabeloes estão presentes, eles são relativamente pouco distribuída, facilitando a estimulação dos indivíduos ou pequenos grupos de folículos mecanicamente. A camada dérmica subjacente fina dá boa acessibilidade aos terminais nervosos com drogas farmacológicas e corantes. Isso os torna particularmente ideal para estudos de imagem por microscopia de fluorescência. A imagem pode ser tanto em terminais vivos, ou após a fixação e posterior processamento histológico.
As respostas de neurónios que enervam mecanosensorial folículos de cabelo têm sido tradicionalmente estudado em roedor vibrissas 1,2 e, em menor grau, em preparações isoladas de pele 3,4. Estes têm ensinou-nos muito sobre os princípios gerais da fisiologia mecanosensorial nas terminações nervosas em torno do eixo do cabelo. A preparação das vibrissas permite um controlo excelente sobre o movimento de um único folículo piloso. No entanto, pode ser difícil para decifrar a saída, devido à sua complexidade, como vibrissasfolículos conter pelo menos 8 tipos diferentes de final mecanosensorial anatomicamente distinta 5 ea correspondência entre estes tipos morfológicos a respostas eletrofisiológicas específicos continua a ser uma questão de disputa. A preparação nervo pele do rato / safena é mais frequentemente usado em seu estado depilada para investigar toque e dor respostas. A inervação dos folículos pilosos em uma tal preparação é menos complexo, mas a densidade dos folículos pilosos, além da presença de três tipos foliculares diferentes (guarda, Awl / auchene e cabelos ziguezague) em tal proximidade 6, significa estudar as respostas específicas de um único folículo ou tipo único de final é novamente um desafio. Além disso, esta preparação envolve uma dissecção complexo. Finalmente, em ambas as vibrissas e outras preparações para a pele, é difícil visualizar as terminações envolvidas enquanto ex vivo preparações estão ainda vivos. Assim, o seccionamento de tecidos é necessária mesmo em linhas de rato que expressam GFP. alternatively, requer mais processamento histológico / imunológico, tais como a fixação e / ou incubação do anticorpo para imunofluorescência.
Temos, portanto, desenvolvido a preparação pavilhão auricular e é usado para fazer gravações elétricos a partir de uma população restrita de aferentes folículo piloso e mostrar que o ciclismo membrana ocorre nessas terminações lanceoladas, evidenciadas por captação de corantes de estirilo pirid�nio. Finalmente, mostrámos que o corante não interfira com sensibilidade mecânica, indicando que ele não bloqueia os canais mecanotransdução. Os resultados de protocolos de estimulação e análise simples são ilustrados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós desenvolvemos uma preparação relativamente simples que pode ser rapidamente dissecados, tem uma baixa densidade do folículo de cabelo e permite a estimulação mecânica relativamente selectiva de um pequeno número de folículos do cabelo. É facilmente acessível para a gravação eletrofisiológico e de imagem fluorescente de células vivas, incluindo as respostas para tingir aplicativo para visualizar os folículos pilosos estimulada mecanicamente, ou seja, os folículos de imagem com respostas eletrofisiológicas definidos. Embora não tenhamos feito isso, este sistema também parece prontamente passível de sub-divisão do nervo sensorial para a unidade única (single axônio sensorial) gravação e usando GFP-expressão direcionados para visualizar a morfologia do terminal terminando sensorial.
Temos usado a preparação da pele da orelha para investigar as características da internalização e libertação dos corantes pridinium estirilo membrana fluorescente 7, uma técnica originalmente desenvolvida para estudar vesic localizadareciclagem membrana le nos terminais sinápticos 8. Em sinapses, imaging também é facilmente combinado com a gravação eletrofisiológico simultânea de respostas em terminais identificados 8,9. Foi nesses estudos iniciais que, primeiro, anotou os corantes também foram internalizados pelas terminações mecanosensorial 10. Para neurônios sensoriais na cultura e nas células ciliadas da cóclea, grande parte da rotulagem por corantes de estirilo pirid�nio parece envolver corantes que passam através dos canais mecanosensorial, que eles bloqueiam 11,12. Os corantes, em seguida, rotular membranas intracelulares, e essa rotulagem é irreversível. No entanto, nas células ciliadas que não são mecanicamente estimulados 13,14 e nos terminais completamente diferenciadas primárias sensoriais nervosas in situ, tais como terminações Ia em fusos musculares 15, e nas terminações lanceoladas aqui 7, rotulagem estiril corante parece refletir a endocitose de membrana, uma vez que a rotulagem é reversível e não bloquear os res mecanosensorialponses 7,15,16. Enquanto alguns internalização corante por permeação canal nessas terminações não pode ser completamente descartado, é evidente a partir da queima continuou durante a incubação corante e a reversibilidade da rotulagem que a grande maioria da rotulagem em terminais diferenciadas in situ é de internalização com vesícula reciclagem membrana. Assim, esta técnica simples é facilmente utilizado para a monitorização eléctrica e óptica combinada de uma variedade de funções do terminal mecanosensorial em tecidos ex vivo.
Tal como acontece com a maioria das técnicas práticas, reprodutibilidade vai exigir a repetição e prática. serão agora descritos alguns dos pontos-chave especial atenção vale a pena. Durante toda a sessão de gravação e dissecção, maximizar a viabilidade do tecido e da sobrevivência, assegurando a preparação é constantemente perfundidos com solução salina totalmente saturado com 95% O2 / 5% de CO 2. Assegurar o cabelo folículos não são deslocados durante este processo, which irá estimular a queima final sensorial. Ou utilizar, num sistema contínuo de fluxo laminar de perfusão, ou cuidadosamente bolha de gás através de um banho de órgãos com tubos finos, a uma distância a partir da preparação, ou actualizar cuidadosamente soluções cada 20-30 min, mantendo a preparação abaixo da superfície da solução salina em todos os momentos. eletrodos de registro de sucção são feitos modificando pipetas de borosilicato eletrodo afiadas normalmente utilizados para a gravação intracelular. Em primeiro lugar, cuidadosamente quebrar as pontas afiadas com # 3 fórceps para dar o diâmetro interno adequado para o ajustar os nervos e fogo-polonês por muito breve (<1 seg) a exposição a chama do queimador de Bunsen (ver 2.4 e 2.5). Para obter uma boa relação sinal-para-ruído durante a gravação, é essencial que a impedância eléctrica (resistência) nestes dois eléctrodos é maximizada e ambos igual. Para fazer isso, prestando atenção para o seguinte nos dois eletrodos. Para o eléctrodo de registo, assegurar o diâmetro interno é um ajuste confortável para o nervo, e o comprimento máximo de NErve é atraído para o eléctrodo de registo. Tente usar o tecido conjuntivo ao redor do nervo para selar eficazmente a ponta do eletrodo. Em alternativa, ou além disso, tirar a parte mais estreita de um pedaço de tamanho adequado, afunilada de tecido adiposo em ao lado do nervo. Em seguida, ligar a extremidade do eléctrodo por aplicação de sucção forte para ~ 1 min com uma seringa de 50 ml ligado à tubagem. Para uma dica bem fechados, aplicação de sucção forte simplesmente reforçar a eficácia da ficha e não vai chamar em mais líquido ou do nervo. Para evitar danos nos nervos, no entanto, garantir que o tecido conjuntivo é amortecer o nervo de compressão sobre o material circundante e da cartilagem EAM. O eletrodo indiferente deve imitar a resistência / impedância do eletrodo de registro, tanto quanto possível. Este é ajudado por cuidadosamente fogo-de polimento a ponta para tão pequeno uma abertura possível sem realmente selando-o. Se ainda mais a resistência é necessário, em seguida, ligue a extremidade do eléctrodo indiferente com AdipoSE tecido conjuntivo, tal como descrito acima para o eléctrodo de registo.
O eletrocerâmicos dá o controle requintado ao longo deslocamento mecânico, tanto espacialmente e temporalmente. No entanto, tome cuidado para fazer as conexões elétricas – altas temperaturas destruí-los, portanto, não use solda quente. Use cola epóxi carregada com metal, ou utilizar uma tomada de encaixe especialista recomendado pelo fornecedor. Isso quer segurá-lo com firmeza e estabelecer a conectividade elétrica. Fixe a sonda estimulante de vidro para o eletrocerâmicos com resina epóxi padrão. Fire-polonês o fim de um padrão cm x 10 tubos capilares de vidro de borosilicato 1,5 milímetros de diâmetro utilizadas para fazer patch ou eléctrodos afiadas para o registo electrofisiológico para minimizar o risco de danos nos tecidos. Se a estimulação folículo piloso única é necessária, fogo-polonês a ponta para caber um único fio de cabelo, e posicionar a sonda com um único fio de cabelo dentro da grande abertura. Isto dá o controle requintado ao longo de um único fio de cabelo. Para dy estirile rotulagem, ele é geralmente mais uniforme em tecidos de animais mais jovens. Não está totalmente claro por que, mas isso provavelmente reflete menos trauma mecânico e remoção mais eficaz do tecido profundo dos tecidos mais jovens. Ser completo na remoção da camada de espuma de poliestireno expandido lembrando que recobre as bases do folículo piloso. No entanto, evitar ser demasiado vigorosa, já que esta corre o risco de remover a camada plexo nervoso e terminais lanceoladas associados. Se houver pouca ou nenhuma resposta eléctrica ao movimento do folículo capilar, e a aplicação estiril corante leva a rotulagem predominante das glândulas sebáceas (amarelo / branco), com autofluorescência distinta da base da haste do cabelo, em vez de terminações lanceoladas (amarelo alaranjado /), apuramento excesso de entusiasmo tem prejudicado os tecidos subjacentes. Finalmente, usando um agente corante quelante antes de imagem melhora consideravelmente o contraste da imagem e qualidade das imagens finais.
Esta técnica pode ser útil numa variedade de estudos suplementares. estes could incluem, por exemplo, o rastreio para o canal (s) mecanosensorial responsável por respostas evocadas por estiramento, por incubação da preparação com ligandos farmacológicos selectivos para os canais de candidatos ou de rastreio de linhas de ratinhos com tais canais geneticamente suprimido. Este último poderia ser combinada com a avaliação de fluorescência de quaisquer alterações na morfologia do terminal devido à manipulação genética em linhas de rato, por exemplo, com expressão GFP Npy2r-linked 17. Um último exemplo pode ser investigar o papel das vesículas sinápticas-like (SLVs) 7 nesses terminais lanceoladas, examinando o efeito de moduladores de volume de negócios SLV (Ca, Mg, latrotoxin, ligantes de receptores de glutamato) sobre as respostas evocadas por estiramento e captação estiril corante /lançamento. Assim, esta nova técnica abre um leque de possibilidades potencialmente interessantes de pesquisa em neurociência mechansensory.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Referencias
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