マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

マウスの死後の組織の収穫が承認された倫理的な方法を使用する必要があります。英国では、頸椎脱臼は、成体マウス（英国動物の上場スケジュール1の方法（科学的手続）法、1986年から欧州指令63分の2010 / EU）のための政府承認された方法です。この法律は、以下のプロトコルで使用されるすべての手順を検討し、承認された動物福祉と倫理審査委員会によって、アバディーン大学で局所的に適用されます。 注：これらの方法は、銀行らに報告された研究で使用した7。 電気生理学1.準備耳解剖前に、このようなLileyの（1956）などの標準的な生理食塩水を調製し、90％O 2/5％CO 2でそれを飽和。 NaHCO 3（12）のKCl（4）、KH 2 PO 4（1）、塩化ナトリウム（138.8）のMgCl 2（1） の CaCl 2（2）及びグルコース：Lileyの生理食塩水（MM）が構成され（11）。 人道的に耳の近くに頭蓋骨を損傷することなく、成体マウスを安楽死させます。ここでは、C57 / Bl6JとMF1マウスを使用していますが、任意の標準的な実験用マウス系統を使用することができます。理想的には、電気的記録が大きく、マウスにおける標識は信頼性が低いとして、スチリル色素標識と組み合わせることである場合は、<25グラムであるマウスを使用し、多くの場合にのみ限定さ外接地域で発見されています。 大きなはさみや骨ハサミで頭を削除します。 ステレオ解剖顕微鏡のステージ上で（50センチメートルが通常便利である）は、広い底解剖皿に毒ガスLileyの中で頭の背側を上に置きます。定期的に（〜10分）水門や毒ガス生理食塩水で頭を沈めます。 慎重外耳道（EAM）の軟骨を露出させ、springbowはさみと＃3鉗子で外耳（耳介）の付け根に皮膚を切開し、分離します。彼らはFをemergeとして三叉神経の枝（下顎部門、MDV）と大きな耳介神経を特定ROM軟骨ベースを介して、顎関節やプロジェクトの裂け目で頭蓋骨はそれぞれ、凹（前方）と凸（後部）耳介皮膚の側面を支配します。 頭蓋骨の近く、どこ顎および乳様突起のプロセス間の溝内の2つの神経枝出口を識別します。静かに頭蓋骨から耳介を引いて、その長さを最大化し、可能な限り頭蓋骨に近い神経を切断します。 分割された神経の遠位断端を避けるように注意しながら、除去される耳の付け根に密な毛の量を最小限に抑え、springbowはさみで頭から耳介を削除します。 柔軟なシリコーンゴム（PDMS）毒ガスLileyの流体で満たさ-lined皿に耳介を転送します。最も狭い（最前方）の時点でそれを分割してEAMを開きます。 〜6-8との縁で慎重にPDMSに耳介、前方皮膚（凹）ダウンサイドピンを平らにし、定期的に（〜0.2ミリメートルの直径）昆虫ピン非常に微細な間隔を置いて配置。 レム耳介の後面の皮オベ完全および部分的に＃3鉗子で鈍的切開により耳介軟骨を除去し、前方の皮膚がそのまま残されている保証します。 細かい虫ピンの点で軽く肌とEAM軟骨の間に後方に現れるMDVの枝（通常は2）を拡張、＃3鉗子で把持。その切断端ではなく、神経幹自身に隣接する結合組織を突き刺す、可能な限り微細昆虫ピンでPDMSにこれらをピン。 慎重に引っ張っ過剰または切断による損傷を避けること、彼らの周りの周囲の結合組織の大部分を削除してください。 2.電気生理学的記録の設定に（記録のために一から二の吸引電極に近い耳の付け根で洗浄神経を配置し、（〜耳あたり6-8）エッジの周りに細かい虫ピンで記録チャンバーのPDMS-並ぶベースに耳介皮膚をピン神経を取る）とOT彼女の不関電極（7を参照して 、差動増幅器にニュートラル信号を提供します）。 記録電極の場合は、慎重に絞りと2神経の合計の厚さへの開口部の内径に一致するので、可能な限り、できるだけ大きい長さとしてぴったりとフィット。 シリコーンゴム管と他の端部に取り付けられた2ミリリットルの注射器から穏やかな吸引によって電極に神経を描画します。折り畳まれたまたはダブルアップしていない、神経がまっすぐであることを確認してください。 しっかりと神経の周りの開口部を封止するプラグを形成するために、結合組織や脂肪組織を描画するために強力な吸引力を利用して高電気抵抗/インピーダンスフィットを開発します。 （それは毛管作用によって充填することができる）、必要に応じて吸引することにより、生理食塩水と他の（無関心）電極を埋めます。 生理食塩水と神経に接触するように記録電極の内部ボア内に同一の記録ワイヤー（銀や白金）を配置電極の（記録）または狭め、火災研磨終了（無関心）。各電極は、2芯シールドケーブルの異なるコアに個別にはんだ付けされています。浴中に浴（アース）電極（銀/塩化銀ペレット）を配置し、記録電極に接続された2つのコアケーブルの画面に、それを接地してください。 オシロスコープの画面上の差動アンプ、フィルタ（バンド渡さ0.2-2 kHzの）、およびビューの別々のチャンネルに二つの電極からの電気的活動をフィード。電気ノイズレベルが似ているチャネルA（記録）とチャネルB（無関心）を確認してください。この段階では、2つの電極がバランスする前に、チャネルAにおける通常の自発的活動電位を見ることができない場合があります。 記録（チャネルA）または無関心（チャネルB）電極のインピーダンスを増加させることにより、電極間のバックグラウンドノイズの違いを是正。いずれかの電極へのさらなる乳輪（脂肪）結合組織を吸引することでこれを行い、および/または50 mlシリンジに大きな吸引力を加えます。 このように「バランスのとれた」後は、（AB）記録を微分し、トレースに、またはとき耳介の縁に毛をなでる自発的な活動電位（APS）を探しに切り替えます。通常より厳しい（高抵抗）シール及び2におけるより平等インピーダンス – アクティビティ（スパイク）が見られない場合は、記録電極における神経のタイトなフィット感と不関電極で疎性結合組織を再確認電極、より良いです。信号：ノイズ比：練習では​​、これは良い品質の（1> 2）を実現します。 コンピュータ上で実行されているラボインターフェースと電気生理学ソフトウェアを介しelectroneurogramを記録します。スパイクのオーディオ出力は、非常に有用であり、オーディオアンプと関連オーディオスピーカーを通して神経像を供給することによって達成することができます。ちょうど白-nが存在しないことによって特定されたベースラインノイズ（上になるように閾値を調整オワーズ）「ヒス」。 披針形の語尾に薬物または蛍光スチリル色素のアクセスを向上させるために、慎重に卵胞の真皮とベースをさらすのx 5ミリメートル（ 図1A、B〜5mmの窓を開け、耳介マージンの近くに皮下脂肪層をはがします）。 （該当する場合は、単に生産窓のレベルで）並置スキン層の間に明確な生理食塩水で満たされたギャップを残して、前余白で脂肪クリア耳皮膚の〜1ミリメートルの折り目を背面端子です。ゆっくりストローク毛がオシロスコープで最大AP出力の領域を見つけるために、皮膚に触れることなく、ピンまたは接地された微細な鉗子で折られた縁部に沿って突出して独特の「クリック」し、オーディオ出力に「ポップ」。 3.録音刺激誘発活動電位位置機械的刺激プローブ – セラミに取り付けられた火造り10cmのホウケイ酸微小電極ガラスCの圧電アクチュエータは、 – そのように動きが皮膚のひだに平行です。それは毛ではなく、肌に触れるので、皮膚のひだから先端約0.5〜1ミリメートルを置きます。ゆっくりとスパイクを聞く/毛を偏向し、観察するために、手動でプローブ先端を移動させることにより、効果的な刺激を確認します。 1-3毛の機械的な刺激駆動するためのソフトウェアを使用します（5 Hzの正弦波で例えば 3秒、10秒毎に。変位200-500ミクロンの探査）、および神経における刺激誘発応答を記録。 10秒間隔で複数の同一の機械的刺激列を与えます。その後、（ 例えば、30秒に10秒からリピート率を落とす）実験プロトコルに従って、刺激の頻度を減らす、再現するためのプローブの位置を最適化します。 高周波ノイズの振幅と最大APの〜25％〜2倍に設定し、単純なしきい値を使用して、 例えば AP-様活性を区別するためにソフトウェアを使用してください。 しきい値を超えるAPをカウント生産APの頻度や特性を定量化する「イベント」、。 4.録音刺激誘発N-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）と組み合わせることで焼成ピリジブロマイドラベリング刺激誘発求心性発射と末端標識上のスチリル色素の影響を調べるために、入浴液に、選択肢のスチリル色素の適切な濃度を追加し、電気的記録を続行します。 必要な露光時間（通常は少なくとも30分）した後、卵胞を表示するための準備を準備します。保持ピンを除去することにより、皮膚弁を展開し、末端標識を明らかにクリア真皮領域を露出させます。 生理食塩水の3完全な変更を行う、無染料の生理食塩水で外部染料を洗い流します。 最も永続的な色素汚染が露出/外部膜から浸出することを可能にするために10〜15分間毒ガス無染料の生理食塩水の最終的な変更でインキュベートします。 金属イオン封鎖剤（スルホブチルβ-シクロデキストリン、1 mMの、5分）、生理食塩水のある膜上に残りの非内在化色素を除去。 直立落射蛍光顕微鏡のステージに記録チャンバーを転送し、ステージ/スライド移動機構を備えたチャンバに係合します。 スチリル色素の励起光の適切なと準備を照らします。卵胞標識（ 図1）を観察するために10Xや25X蛍光顕微鏡の対物レンズを使用してください。